滕新栋，陈晓光，姜 华，顾长美，朱 可

(1.山东国际旅行卫生保健中心， 山东 青岛 266000； 2.威海出入境检验检疫局， 山东 威海 264200)

microRNAs(miRNAs)是一类微小、非编码和高度保守的单链RNA，可通过靶向信使RNA(mRNA)特异地调节基因表达。它具有多种生物学功能，在肿瘤、糖尿病和感染性疾病等多种疾病中发挥着重要调节作用。研究表明，血清或血浆中的循环miRNAs可作为筛选结核病(tuberculosis,TB)的重要靶标。

肺TB是由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病，严重威胁着人类健康。据世界卫生组织(WHO)报道，2015年有1 040万新发TB病例，全球人口1/3感染M.tb(M.tuberculosis)[1]。鉴于TB的严重程度和TB诊断方法的发展情况，早期诊断对控制肺TB至关重要，但是目前没有有效的诊断肺TB的靶标。因而，需要发展全新、快速、敏感和有效的标志物来诊断肺TB。

本研究旨在利用高通量测序和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)探讨肺TB患者和健康人血浆中miRNAs的差异表达情况，发现有诊断价值的miRNAs种类，为后续TB诊断试验和机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象:选取青岛市黄岛区结核病防治所的肺TB患者5例，选取标准为痰涂片阳性或痰培养阳性。选取山东国际旅行卫生保健中心的健康人5名，选择标准为T-SPOT.TB阴性，无TB及其他疾病史，未接触过TB患者。所有研究对象均阅读并签署知情同意书，该研究经青岛大学附属医院伦理委员会批准。

1.1.2 试剂:Trizol®Reagent、6% Novex TBE PAGE gel(1.0 mm，10 well)和TBS380 Picogreen(Invitrogen公司)；miRNA第一链cDNA合成(加尾法)试剂盒和2×SG Fast qPCR Master Mix[生工生物工程(上海)股份有限公司)]；TruseqTMSmall RNA sample prep Kit、HiSeq 4000 PE Cluster Kit、HiSeq 4000 SBS Kit(300 cycles)和MiSeq Reagent Kits v3(600 cycles)(Illumina公司)；Certified Low Range Ultra Agarose(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 标本收集:用EDTA抗凝的旋盖采血管收集肺TB患者和健康人……