王敏 刘其礼 许帅 李品玉 李俊涛

[摘要] 目的 探讨鸦胆子苦醇在非小细胞肺癌A549、H460细胞增殖中的作用。 方法 采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测鸦胆子苦醇对A549、H460细胞的半数抑制浓度（IC50）；Hoechst33258染色，倒置荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态学变化；通过CCK-8法检测细胞活力；Annexin-V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡；Western blot免疫印迹法检测A549、H460细胞Nrf2、Notch1蛋白表达。 结果 鸦胆子苦醇处理A549、H460细胞的IC50分别为（0.70±0.03）、（0.47±0.05）μmol/L；流式细胞试验结果显示，鸦胆子苦醇处理后A549、H460细胞凋亡率显著升高，与对照组比较差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）；Western blot检测结果显示，鸦胆子苦醇可降低细胞内Nrf2、Notch1的蛋白表达。 结论 鸦胆子苦醇可以抑制A549、H460细胞的生长，其机制可能与抑制Nrf2-Notch1信号轴有关。

[关键词] 鸦胆子苦醇；非小细胞肺癌；Nrf2；Notch1；细胞生长

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）07（a）-0016-04

Study on the mechanism of the influence of Brusatol for the Nrf2-Notch1 axis of non-small cell lung cancer

WANG Min LIU Qili XU Shuai LI Pinyu LI Juntao

Faculty of Basic Medicine， Zhaoqing Medical College， Guangdong Province， Zhaoqing 526020， China

[Abstract] Objective To explore the effects of Brusatol in the proliferation of A549 and H460 cells of non-small cell lung cancer. Methods The median inhibitory concentration （IC50） of Brusatol for A549 and H460 cells was assessed by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） assay. Through hoechst33258 staining， the morphological changes of cell apoptosis were observed under the inverted fluorescence microscope. The cell viability was detected by CCK-8. The cell apoptosis was tested by Annexin-V-FITC/PI staining. The expression of Nrf2 and Notch1 protein of A549 and H460 cells was measured by Western blot. Results The IC50 of A549 and H460 cells dealt with Brusatol was （0.70±0.03）， （0.47±0.05） μmol/L respectively. The results of flow cytometry showed that the apoptosis rates of A549 and H460 cells dealt with Brusatol were increased obviously， which had highly statistically significant differences compared with those of control group （all P < 0.01）. The results of Western blot showed that Brusatol could decrease the expression of Nrf2 and Notch1 protein. Conclusion Brusatol can inhibit the growth of A594 and H460 cells， the mechanism may be related to the inhibition of Nrf2-Notch1 axis.

[Key words] Brusatol； Non-small cell lung cancer； Nrf2； Notch1； Cell growth

鴉胆子苦醇（Brusatol）是一种苦木内酯类化合物，从鸦胆子中提取获得。鸦胆子苦醇具有抗炎、驱虫、抗疟、抗癌等多种生物学功能。既往研究发现，鸦胆子苦醇可调节Nrf2信号通路的表达[1]。Nrf2信号通路是内源性的抗氧化通路。当细胞处于稳态时，细胞内Nrf2处于低水平状态[2]。当细胞受到外界刺激时，Nrf2进入细胞核，与相应的抗氧化作用元件结合，启动下游一系列抗氧化物酶，如血红素氧化酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidases）等的表达，从而起到对机体的防护作用[3]。Kitamura等[4]认为Nrf2及其下游蛋白的高表达与肿瘤细胞的增殖、存活有关。Notch1信号通路主要参与细胞的分化、凋亡等过程[5]。Natsuizaka等[6]证实抑制Notch1活性可显著降低肿瘤细胞的增殖和生长速度。有文献报道，Nrf2信号通路可与Notch1信号通路有交叉互作反应，如：Nrf2缺陷表达小鼠中，Notch1表达有所下降[7-8]。目前，鲜见鸦胆子苦醇对Nrf2及Notch1信号通路共同影响的研究，同时，鸦胆子苦醇对非小细胞肺癌生长、存活的影响机制还不完善。因此，本研究以Nrf2-Notch1信号轴为研究基础，探讨鸦胆子苦醇对非小细胞肺癌生长的影响及作用机制，为非小细胞肺癌靶向药物的研制提供一定的实验数据支持。

1 材料与方法

1.1 试剂

鸦胆子苦醇购自上海同田生物技术股份有限公司（批号：112586）；二甲基亚砜（DMSO）（批号：STBG-9203）、四甲基偶氮唑盐（MTT）（批号：STBG9651）购自Sigma公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒购自东仁化学科技有限公司（批号：KJ651）；Hoechst33258购自Thermo Fisher公司（批号：1842729）；胎牛血清购自美国Hyclone公司（批号：AB10114599）；RPMI-1640培养基购自美国Gibico公司（批号：1868807）；Nrf2（批号：BL671）、Notch1（批号：BL549）购自Cell Signaling Technology公司；β-actin（批号：CJ39154）、HRP标记的山羊抗兔（批号：CJ36131）购自巴傲得生物科技有限公司。

1.2 细胞培养

非小细胞肺癌细胞系A549、H460购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，放置于5%CO2、37℃恒温培养箱（Thermo，美国）中培养。

1.3 半数抑制浓度（IC50）计算

将对数期细胞A549、H460细胞5000个接种于96孔板24 h后，加入不同浓度（0.175、0.35、0.70、1.4、2.8 μmol/L）的鸦胆子苦醇，并以相同浓度的DMSO作为对照，培养48 h后，每孔加入50 μL MTT（5 mg/mL），孵育4 h后，弃上清，加入200 μL DMSO，10 min振荡后，于酶标仪检测570 nm处细胞的OD值，并计算细胞IC50。

1.4 细胞形态学观察

将对数期细胞接种于6孔板中，培养24 h，加入0.70、0.47 μmol/L鸦胆子苦醇分别处理A549、H460细胞后继续孵育24 h，弃上清，PBS清洗3次，每次5 min，4%多聚甲醛固定30 min，弃上清，PBS清洗3次，每次5 min，加入200 μL Hoechst33258染液，作用5 min，PBS清洗2次，荧光显微镜下形态学观察。

1.5 细胞存活的测定

0.70、0.47 μmol/L鸦胆子苦醇分别处理A549、H460细胞24 h后，每孔2000个细胞数接种于96孔板，培养24、48、72 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，培养2 h后酶标仪检测450 nm处细胞OD值，即可间接反映细胞的增殖。以上述同样方法加相同浓度的DMSO作为对照。

1.6 细胞凋亡的检测

0.70、0.47 μmol/L鸦胆子苦醇分别处理A549、H460细胞24 h后，胰酶消化收集细胞，PBS洗3次，1000 r/min离心5 min（r = 9.5 cm），加500 μL Binding缓冲液重悬细胞，避光，加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液，流式細胞仪上机检测。以上述同样方法加相同浓度的DMSO作为对照。

1.7 Western blot检测蛋白水平

0.70、0.47 μmol/L鸦胆子苦醇处理A549、H460细胞24 h后，弃上清，PBS清洗3次，每次5 min，加1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，细胞刮刀收集细胞，超声破碎细胞，4°C，10 000 r/min离心10 min，收集蛋白上清。BCA法检测蛋白浓度，50 μg蛋白进行上样，10%SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白电泳分离，PVDF转膜后，5%BSA封闭。一抗孵育4°C过夜，次日，二抗室温2 h，Alpha Innotech FluorChem？郇Q多色荧光凝胶成像分析系统进行曝光，AlphaView SA3.4.0软件进行数据处理和分析。以上述同样方法加相同浓度的DMSO作为对照。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量资料以均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鸦胆子苦醇对A549、H460细胞增殖的抑制作用

鸦胆子苦醇对A549、H460细胞都有一定的抑制作用。鸦胆子苦醇对A549、H460细胞的IC50分别为（0.70±0.03）、（0.47±0.05）μmol/L。本研究选择0.70、0.47 μmol/L的鸦胆子苦醇作为处理A549、H460细胞的后续实验药物剂量。

2.2 鸦胆子苦醇对A549、H460细胞存活的影响

0.70、0.47 μmol/L鸦胆子苦醇分别处理A549、H460细胞，孵育12、24、48 h后，A549、H460细胞存活降低。H460细胞的抑制效果与A549抑制效果无差异。见图1。

2.3 鸦胆子苦醇对A549、H460细胞形态学影响

鸦胆子苦醇0.70、0.47 μmol/L分别处理A549、H460细胞24 h后，与对照组均匀荧光比较，A549、H460细胞的细胞核呈现致密浓染颗粒状状态，可见明显凋亡小体的出现（图2箭头所示）。对凋亡小体进行统计学分析，发现处理组A549、H460细胞与对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图2。

与对照组比较，**P < 0.01

2.4 鸦胆子苦醇对A549、H460细胞凋亡的影响

如图3所示，A549细胞株中，对照组凋亡率为4.66%，鸦胆子苦醇处理24 h后，细胞凋亡率上升至36.7%；H460细胞株中，对照组凋亡率为5.76%，鸦胆子苦醇处理24 h后，细胞凋亡率上升至53.8%。

2.5 鸦胆子苦醇对Nrf2信号通路的影响

如图4所示，0.70、0.47 μmol/L鸦胆子苦醇处理A549、H460细胞24 h后，两种细胞中Nrf2蛋白被抑制，同时，Notch1蛋白也被抑制。

3 讨论

鸦胆子苦醇作为传统中药，含有多种苦木内酯类化合物，研究表明这类化合物具有抗癌、抗炎、抗疟疾等多种功效，但目前关于鸦胆子苦醇的生物学效应及作用机制研究较少[9]。本研究主要探究鸦胆子苦醇作用于人肺癌细胞的相关生物学效应。

Nrf2调控的靶基因主要有各种抗氧化或解毒蛋白，这些靶基因的激活是机体抵御氧化应激损伤的主要作用因子。Nrf2信号通路的激活可以抵抗外界对细胞的不利刺激[10]，有研究表明[11]，304例非小细胞肺癌患者组织样本中，Nrf2蛋白的高表达发生率为26%。此外Nrf2的高表达在前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌细胞中也被发现[12-14]，Nrf2的高表达可以增强肿瘤细胞的增殖、辐射抗性和药物抗性[15]。A549、H460细胞都被证实有Nrf2蛋白的高表达[16]，说明A549细胞和H460细胞具有较强的抗外界刺激的能力。

本研究发现，鸦胆子苦醇诱导A549细胞的浓度大于鸦胆子苦醇处理H460细胞的浓度，说明A549细胞相比H460细胞具有更强的抗性。鸦胆子苦醇处理A549、H460细胞后，细胞呈现致密浓染的颗粒状荧光，其细胞核出现凋亡小体，联合流式细胞术检测结果，鸦胆子苦醇处理细胞可以诱导非小细胞肺癌发生凋亡。有研究表明，鸦胆子苦醇是Nrf2的抑制剂[17]。在本研究中，经鸦胆子苦醇处理后，非小细胞肺癌A549和H460细胞中Nrf2的蛋白表达明显降低，推测Nrf2蛋白含量的降低有可能是鸦胆子苦醇诱导细胞凋亡的原因之一。有报道显示，10%的非小细胞肺癌患者呈现Notch1的高表达状态，同时这一高表达与患者低治愈率有关[18]。下调Nrf2可降低非小细胞肺癌中Notch1及其下游蛋白Hes1等蛋白的表达[19]。本研究检测了Notch1蛋白的表达，发现经鸦胆子苦醇处理后的细胞中Notch1的蛋白表达也有所下降，该结果提示，鸦胆子苦醇有可能是通过抑制Nrf2-Notch1这一信号轴，来实现降低A549、H460细胞增殖与存活并增强肿瘤细胞凋亡的目的。本研究结果提示，鸦胆子苦醇可以作为治疗非小细胞肺癌的潜在药物，为临床治疗非小细胞肺癌提供一定的指导作用。

[参考文献]

[1] Mei W，Shi G，Bian C，et al. UVA Irradiation Enhances Brusatol-Mediated Inhibition of Melanoma Growth by Downregulation of the Nrf2-Mediated Antioxidant Response [J]. Oxid Med Cell Longev，2018，2018：9742154.

[2] Basak P，Sadhykhan P，Sarkar P，et al. Perspectives of the Nrf-2 signaling pathway in cancer progression and therapy [J]. Toxicol Rep，2017，4：306-318.

[3] Uchida H，Nakajima Y，Ohtake K，et al. Protective effects of oral glutathione on fasting-induced intestinal atrophy through oxidative stress [J]. World J Gastroenterol，2017， 23（36）：6650-6664.

[4] Kitamura H，Motohashi H. NRF2 addiction in cancer cells [J]. Clin Lung Cancer，2018，109（4）：900-911.

[5] Mack JJ，Mosqueiro TS，Archer BJ，et al. NOTCH1 is a me-chanosensor in adult arteries [J]. Nat Commun，2017，8：1620.

[6] Natsuizaka M，Whelan KA，Kagawa S，et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma [J]. Nat Commun，2017，8（1）：1758.

[7] Wakabayashi N，Shin S，Slocum SL，et al. Regulation of notch1 signaling by nrf2：implications for tissue regeneration [J]. Sci Signal，2010，3（130）：ra52.

[8] Wakabayashi N，Chartoumpekis DV，Kensler TW，et al. Cr-osstalk between Nrf2 and Notch signaling [J]. Free Radic Biol Med，2015，88（Pt B）：158-167.

[9] 傅麗霞，黄崇刚，林明宝，等.鸦胆子苦木内酯类成分及其药理活性研究进展[J].中国药理学通报，2016，32（11）：1481-1486.

[10] Liddell JR. Are Astrocytes the Predominant Cell Type for Activation of Nrf2 in Aging and Neurodegeneration？ [J]. Antioxidants（Basel），2017，6（3）：E65.

[11] Solis LM，Behrens C，Dong W，et al. Nrf2 and Keap1 abnormalities in non-small cell lung carcinoma and association with clinicopathologic features [J]. Clin Cancer Res，2010，16（14）：3743.

[12] Romero R，Sayin VI，Davidson SM，et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in a dependence on glutaminolysis [J]. Nat Med，2017，23（11）：1362-1368.

[13] Jung BJ，Yoo HS，Shin S，et al. Dysregulation of NRF2 in Cancer：from Molecular Mechanisms to Therapeutic Opportunities [J]. Biomol Ther（Seoul），2018，26（1）：57-68.

[14] Taguchi K，Yamamoto M. The KEAP1-NRF2 System in Cancer [J]. Front Oncol，2017，7：85.

[15] Malavolta M，Bracci M，Santarelli L，et al. Inducers of Senescence，Toxic Compounds，and Senolytics：The Multiple Faces of Nrf2-Activating Phytochemicals in Cancer Adjuvant Therapy [J]. Mediators Inflamm，2018，2018：4159013.

[16] Singh A，Bodas M，Wakabayashi N，et al. Gain of Nrf2 Function in Non-Small-Cell Lung Cancer Cells Confers Radioresistance [J]. Antioxid Redox Signal，2010，13（11）：1627-1637.

[17] Ma R，Li H，Zhang Y，et al. The toxic effects and possible mechanisms of Brusatol on mouse oocytes [J]. PLoS One，2017，12（5）：e0177844.

[18] Westhoff B，Colaluca IN，D'ario G，et al. Alterations of the Notch pathway in lung cancer [J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（52）：22293-22298.

[19] Zhao Q，Mao A，Yan J，et al. Downregulation of Nrf2 promotes radiation-induced apoptosis through Nrf2 mediated Notch signaling in non-small cell lung cancer cells [J]. International J Oncol，2016，48（2）：765-773.

（收稿日期：2018-02-26 本文編辑：张瑜杰）