肖婷焱 段无暇 许紫薇 周寿红 曾斌

[摘要] 目的 观察转录激活因子4（ATF4）过表达对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响，并探讨其机制。 方法 构建ATF4表达质粒，采用脂质体瞬时转染HepG2细胞。实验分为空白对照组、空质粒组和ATF4质粒组。采用流式细胞术检测细胞凋亡率，检测HepG2细胞培养液中乳酸含量，Western blot检测Warburg效应蛋白M2型丙酮酸激酶（PKM2）的表达。 结果 与空质粒组比较，ATF4质粒组HepG2细胞凋亡率显著增加，细胞培养液中乳酸含量显著降低，HepG2细胞中PKM2蛋白的表达显著下调（均P < 0.05）。 结论 过表达ATF4促进HepG2细胞的凋亡，其机制可能与抑制Warburg效应有关。

[关键词] 肝细胞性肝癌；细胞凋亡；转录激活因子4；Warburg效应；M2型丙酮酸激酶

[中图分類号] R34 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）07（a）-0012-05

Effect and mechanism of overexpression of ATF4 on the apoptosis of HepG2 cells

XIAO Tingyan1 DUAN Wuxia1 XU Ziwei1 ZHOU Shouhong2 ZENG Bin1

1.Department of Gastroenterology， the First Affiliated Hospital of University of South China， Hu'nan Province， Hengyang 421001， China； 2.Teaching and Research Office of Physiology， Medical College， University of South China， Hu'nan Province， Hengyang 421001， China

[Abstract] Objective To observe the effect of overexpression of activating transcription factor 4 （ATF4） on the apoptosis of HepG2 cells and explore the mechanism. Methods ATF4 expression plasmid was built. Hepatocellular carcinoma line HepG2 cells were transfected with ATF4 expression plasmid through liposome. The plasmids were divided into blank control group， empty plasmid group and ATF4 plasmid group. The apoptosis rate was detected by flow cytometry. The content of lactate in cell culture medium was tested. The expression of Warburg effect protein pyruvate kinase subtype M2 （PKM2） was measured by Western blot. Results Compared with the empty plasmid group， the apoptosis rate of HepG2 cells increased significantly， the content of lactate in cell culture medium decreased significantly and the expression of PKM2 decreased significantly （all P < 0.05）. Conclusion Overexpression of ATF4 promotes the apoptosis of hepatocellular carcinoma line HepG2 cells， the mechanism may be related to inhibition of Warburg effect.

[Key words] Hepatocellular carcinoma； Apoptosis； Activating transcription factor 4； Warburg effect； Pyruvate kinase subtype M2

肝细胞癌（简称“肝癌”）是原发性肝癌的主要类型，其发病率近年来持续攀升，已经成为全球第二大致命性癌症[1-2]。转录激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）是ATF/CREB家族的成员之一，能够调控适应性关键基因的转录，参与氨基酸的合成与运输、糖脂代谢及整合应激反应等多种生物学功能[3-4]。ATF4通路在诱导肿瘤细胞凋亡、调节肿瘤自噬中起着关键作用[5-6]。Warburg效应是肿瘤细胞独特的能量代谢方式，M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase subtype M2，PKM2）是最重要的一种Warburg效应相关蛋白，在大多肿瘤细胞中呈高表达[7]。本研究旨在探讨过表达ATF4下调Warburg效应相关蛋白PKM2表达及对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株及试药

人肝癌细胞系HepG2（南华大学微生物研究所）。二甲基亚砜（杭州四季青公司，批号：171014）；Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司，批号：1705567）；ATF4质粒及空载质粒（上海吉凯基因公司，批号：170506）；质粒小提试剂盒（北京天根生物技术公司，批号：1701016）；Loading-Buffer上样缓冲液（北京碧云天生物技术公司，批号：ST506）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京碧云天生物技术公司，批号：G1712）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（北京碧云天生物技术公司，批号：p0017s）；流式细胞凋亡检测试剂盒（北京联科生物技术公司，批号：170513）；L-乳酸盐检测试剂盒（北京九强生物有限公司，批号：170621）；PKM2兔抗人单克隆抗体（美国Cell Signaling公司，批号：170-21）；GAPDH兔抗人单克隆抗体（北京博奥森有限公司，批号：bs-0061R）；辣根标记山羊抗兔IgG（北京博奥森有限公司，批号：Zbs0175R）；辣根标记山羊抗鼠IgG（北京博奥森有限公司，批号：Zbs0175R）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 使用1640培养基培养人肝癌细胞HepG2，培养基含10%胎牛血清。培养条件：37℃，5%CO2。每1～2天进行细胞换液，当细胞融合度达80%～90%时，进行细胞传代、细胞冻存或用于后续实验。实验分为空白对照组、空质粒组和ATF4质粒组。

1.2.2 ATF4过表达质粒的构建及质粒DNA提取 ATF4过表达质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司构建，载体名称为GV362。元件顺序：CMV-MCS-3FLAG-IRES-EGFP-SV40-Neomycin；克隆位点：XhoI/BamHI；对照编号：CON236。ATF4过表达质粒构建好后，对目的基因进行阳性克隆测序分析，证明成功构建ATF4表达质粒。以LB粉剂加入一级水配制成LB液，高压蒸汽滅菌备用。细菌操作台内将卡那霉素加入上述LB培养液中。以含质粒（ATF4或空质粒）的菌液分别加入LB培养液中，37℃、180 r/min摇床上震荡培养16 h。按质粒小提试剂盒中操作说明进行提取纯化质粒用于后续实验。

1.2.3 细胞转染 HepG2细胞按106个/孔接种于6孔板中，含10%胎牛血清1640培养基培养，待细胞均匀铺满孔板90%时转染。去培养液，PBS冲洗2遍。配制转染混合液：A液为4 μg ATF4表达质粒（或空质粒载体）用无血清1640培养基稀释成250 μL。B液为10 μL Lipofectamine 2000用无血清1640培养基稀释成250 μL。B液静置5 min后，混合A液和B液，混合后静置20 min后成为转染混合液。将上述转染混合液按分组加入6孔板内，轻轻晃动混匀，放入培养箱内孵育4～6 h后，PBS清洗2遍，加入含10%小牛血清的1640培养基后，置于培养箱中继续培养。48 h后于荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况，并计算转染率。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术检测细胞凋亡 采用Annexin V-PE/7-AAD荧光染色法检测细胞凋亡。收集各组HepG2细胞于离心管中，离心半径为55 mm，1000 r/min，离心5 min，弃上清，冷PBS洗涤2次，调整细胞密度为1×106/mL，将细胞悬于1×结合缓冲液中，加5 μL Annexin V-PE和10 μL 7-ADD，轻轻混匀冰上避光反应15 min，加380 μL冷的1×结合缓冲液，重复3次，上机检测。每次计细胞数6000个，记录激发波长488 nm处红色荧光，流式细胞仪分析不同DNA含量的细胞分布，用分析软件CellQuest检测凋亡率。

1.2.5 Western blot检测PKM2蛋白表达 HepG2细胞经转染48 h后加入含PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30～40 h，离心半径为30 mm，14 000 r/min离心10 min，收集上清液。BCA法定量蛋白浓度。RIPA裂解液稀释、配平蛋白，加入Loading-Buffer上样缓冲液。PCR仪中99℃、10 min煮沸使蛋白变性。配制好SDS-PAGE凝胶，加入适量蛋白样品至加样孔后电泳。切出目的胶并裁剪相应的PVDF膜，以150 mA恒定电流将目的蛋白转至PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭PVDF膜2 h。一抗anti-ATF4（1∶2000）、anti-PKM2（1∶1000）和anti-GAPDH（1∶2000）孵育过夜。二抗孵育2 h。显影。采用Image J软件处理结果并进行数据分析。

1.2.6 L-乳酸盐检测试剂盒检测细胞培养液内的乳酸分泌量 HepG2细胞按105个/孔接种于24孔板中，培养贴壁，每组设置8个复孔，转染48 h后备用。分别收集各孔细胞培养液样品，按乳酸检测试剂盒操作说明检测各样本中的乳酸含量（mmol/L），记录数据结果。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0对实验数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多个样本间的数据比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达ATF4的HepG2细胞系的建立

光镜下可见转染后的HepG2细胞形态正常，具有良好的透光度，没有出现明显的大片细胞死亡以及细胞碎片的形成。荧光显微镜下可见转染组EGFP阳性细胞数明显增加，转染效率达到（84.56±5.83）%。见图1。

2.2 过表达ATF4对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

与空质粒组比较，ATF4质粒组的HepG2细胞凋亡率显著升高（P < 0.05），而空质粒组与空白对照组细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2。

2.3 过表达ATF4对HepG2细胞培养液中乳酸含量的影响

与空质粒组比较，ATF4质粒组HepG2细胞培养液中乳酸含量显著减少（P < 0.05），而空质粒组与空白对照组HepG2细胞培养液中乳酸含量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图3。

2.4 过表达ATF4对HepG2细胞中PKM2蛋白表达的影响

与空质粒组比较，ATF4质粒组HepG2细胞中PKM2蛋白的表达水平显著下调（P < 0.05），而空质粒组与空白对照组HepG2细胞中PKM2蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图4。

3 讨论

肝癌的发生发展受肝癌细胞本身、肝癌与微环境之间相互作用等多方面因素的影响，肝癌的发生伴随着细胞形态变化、功能缺失及细胞代谢的显著改变等[8-10]。ATF4是一种未折叠反应蛋白，参与多种细胞生物学功能，其主要功能包括氨基酸的合成与运输、能量代谢、糖脂代谢及整合应激反应等[11]。研究发现ATF4参与调节肿瘤细胞凋亡，影响着肿瘤细胞的发生发展[12]。研究表明，ATF4过表达能诱导大肠癌细胞发生凋亡[13]。Lee等[14]发现，内质网应激时，ATF4能够调节黄猩猩果蝇细胞的糖酵解相关基因的表达。研究表明，过表达ATF4基因的裸鼠横纹肌肉瘤成瘤体积小于野生型裸鼠，表明ATF4能诱导肿瘤细胞发生凋亡，其作用机制可能与诱导下游基因ANSN表达有关[15]。本研究结果发现，ATF4过表达可促进肝癌HepG2细胞发生凋亡。但是ATF4的作用机制尚不完善，其作为未折叠蛋白因子影响肿瘤细胞的功能已经比较明确，但ATF4在通过调节代谢通路而影响肿瘤方面的作用尚不清楚，因此，ATF4作为肿瘤代谢调控因子的功能有待进一步探讨。

Warburg效应是肿瘤细胞代谢的主要标志之一，即细胞在氧充足的条件下仍以糖酵解为主产生大量乳酸。许多肿瘤组织中都能观察到Warburg效应，包括肝癌、结肠癌、肺癌、恶性胶质细胞瘤等[16]。研究显示，下调Warburg效应相关蛋白的表达能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡[17]。Warburg效应能够促进肿瘤细胞增殖，有氧糖酵解影响肿瘤发展、迁移及治疗等多方面，抑制肿瘤细胞的有氧糖酵解表型能够促进肿瘤细胞凋亡[18]。

Warburg效应包括丙酮酸激酶等酶基因在内的多个作用靶点，这些作用位点统称为Warburg效应相关蛋白，调节这些酶基因表达都能直接影响Warburg效应。丙酮酸激酶有四种表型，PKM2是其中最主要的肿瘤表型。通常来说，PKM1主要存在于非增生性组织中，而PKM2则为增殖性组织中所特有。PKM1向PKM2表型的转换是PKM2在许多癌症细胞中呈高表达的主要原因，这说明Warburg效应相关蛋白PKM2具有致瘤性。研究显示，PKM2促进结肠癌细胞的增殖及迁移，并且能够介导Warburg效应的建立，是Warburg效应的重要标志物[19-20]。然而ATF4是否对肿瘤Warburg效应有调节作用尚未见报道。本研究结果发现，过表达ATF4可下调HepG2细胞PKM2的表达，减少肝癌HepG2细胞乳酸生成，表明过表达ATF4可抑制肝癌HepG2细胞Warburg效应。因此推测过表达ATF4可促进肝癌HepG2细胞凋亡的机制可能与抑制Warburg效应有关。

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