董泽丰，夏 瑜，王 笛，沈 强，雅雪蓉

(苏州市疾病预防控制中心，江苏苏州 215004)

2013年3月中国华东地区首次发现人感染新型重组H7N9禽流感病毒病例[1]。自此之后人感染H7N9禽流感疫情在每年冬春季都会出现季节性流行，报告病例的病死率超过30%[2]。截至2018年2月，中国大陆累计报告1 566例病例，其中613例死亡，报告病死率为39.14%(613/1 566)，远远超过感染季节性流感病毒病例的病死率，但是低于人感染H5N1亚型禽流感病毒病例接近60%的病死率[3-4]。2016-2017年的疫情流行季中，实验室确诊病例数及地理分布范围明显超过以往流行季，引起了广泛的社会关注[5-6]。苏州市疾控中心于2013年4月确诊了本地首例人感染H7N9病例，自此，人感染H7N9禽流感疫情防控成为本市重要的公共卫生工作之一。研究表明直接接触活禽或暴露于被病毒污染的活禽市场环境是主要的感染途径[2,7]，一些散发的聚集性疫情也偶有报道[8-11]。苏州市也发生了两起人感染H7N9禽流感病毒家庭聚集性疫情。为实现精准防控，防止疫情蔓延，本研究调查了两起疫情的流行病学和病原学特征。

1 资料与方法

1.1一般资料 采集H7N9病例及其密切接触者咽拭子标本，同时收集患者流行病学数据及主要临床症状等信息。密切接触者是指H7N9病例发病后，所有在无保护条件下接触患者或暴露于可能被病毒污染环境的人。所有密切接触者隔离观察至少10 d，24 h内完成检测，A(H7N9) 病毒阳性标本立即-80 ℃保存备用。

1.2方法

1.2.1核酸提取 吸取200 μL原始咽拭子标本，参照Roche公司的高纯度病毒核酸试剂盒说明书提取病毒核酸。

1.2.2病毒检测 参照上海之江公司A/B和H7N9病毒实时荧光-聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒说明书，取5 μL样品核酸提取液、DEPC-H2O、阳性对照分别加入20 μL配好的反应液中，离心混匀后放入ABI7500 PCR扩增仪检测，总反应体系为25 μL。扩增条件为45 ℃×10 min；95 ℃×15 min；再按95 ℃×15 s，60 ℃×60 s；循环40次，单点荧光检测在60 ℃。

1.2.3病毒分离 吸取200 μL抗菌处理后的咽拭子标本接种于9～11 d日龄的SPF级鸡胚尿囊腔，35 ℃培养72 h后收获尿囊液。病毒分离培养及序列测定在国家流感中心P3实验室完成。

1.2.4序列分析 DNAStar7.0软件进行同源矩阵分析，MEGA6.0软件构建血凝素(HA)基因序列N-J进化树，bootstrap重复值为1 000。HA基因参考序列下载自GISAID网站。

2 结 果

2.1病例信息 第一起疫情：2例患者均35岁，为在苏州务工的李姓双胞胎兄弟，李1职业为货车司机，李2职业为某公司食堂厨师。兄弟2人于2016年1月18-26日一直陪护在病房照顾因肺部疾患入院治疗的父亲。患者李1于1月30日发病，自诉发病前无活禽接触和食用史。李2因相似症状于2月4日在苏州某医院住院，因病情加重，2月6日，兄弟2人一起转入苏州市第五人民医院ICU隔离治疗。2人咽拭子标本经苏州市疾控中心检测，均为H7N9禽流感病毒核酸阳性。2人首次使用达菲等抗病毒治疗(奥司他韦，每次75 mg，1日2次)的时间分别为2月3、4日。由于治疗及时，经过3周左右的规范抗病毒治疗，2例H7N9病例相继康复出院。此外，5名密切接触者实施医学观察期间均无急重症呼吸道感染症状，密切接触者咽拭子标本及14份外环境标本(含禽类粪便、肛拭子)H7N9核酸检测结果均为阴性。

第二起疫情：首发病例韩1是一名66岁的退休男性，有高血压病史，无直接活禽接触史，但是发病前10 d内经常到有贩卖活禽的菜市场买菜。2016年11月26日出现呼吸道感染症状，2 d后因不明原因肺炎住院治疗，12月2日韩1的咽拭子标本经苏州市疾控中心检测为H7N9禽流感病毒核酸阳性，确诊后随即采用达菲等抗病毒治疗(奥司他韦，每次75 mg，1日2次)。12月12日，病例死亡。二代病例韩2是韩1的女儿，39岁，无基础疾病，自诉无活禽接触史或暴露于活禽市场环境，但是，她于11月28日至12月2日在医院照顾其父亲韩1，并在无保护条件下接触韩1痰液等分泌物。12月6日，韩2出现流感样症状，随即被收治住院进行抗病毒治疗。12月15日被确诊感染H7N9禽流感病毒，经过3周规范治疗于12月31日康复出院。外环境标本H7N9禽流感病毒核酸阳性率为30%(12/40)。

2.2序列分析 HA基因进化树见图1，H7N9病毒仍在不断进化，不同流行季测得的病毒处在不同的进化分支上。序列比对表明苏州两起聚集性疫情中测得的H7N9基因序列均为长三角分支，与广东和台湾等地发现的高致病性突变株不同，HA链接肽位置未有核苷酸插入。第二起疫情测得的病例及外环境H7N9病毒HA序列高度同源，HA序列一致性大于99.99%，与候选疫苗株A/Anhui/01/2013的HA基因序列一致性为98.00%。

2.3氨基酸序列分析 HA蛋白受体结合位点关键氨基酸序列没有发生改变，与候选疫苗株A/Anhui/01/2013(H7N9)相比，受体结合位点关键氨基酸仍为160A、186V、226L及228G。 仍然保留了SA-α2、3-Gal 和 SA-α2、6-Gal的双受体结合能力。HA切割位点氨基酸序列为 PEIPKGR↓GLF，仅有一个碱性氨基酸R，未发现有多个碱性氨基酸插入，不同于高致病突变株A/Guangdong/17SF003/2016(H7N9)，提示苏州流行的H7N9病毒对禽类仍为低致病性的。未发现 NA蛋白耐药位点(E120G、R153K、H276Y和R294K)发生变异。

注：黑色圆点和三角分别代表从第一起和第二起疫情分离的病毒，菱形标的为高致病突变株

图1苏州聚集性疫情中H7N9病毒HA基因Neighbor-Joining进化树

3 讨 论

自2013年首次发现以来，H7N9病毒已经引起了五波流行[5]，报告病例的病死率高[12]，苏州每年冬春季都有若干散发病例报告，远超季节性流感病毒(H1N1、H3N2和B型)感染病例的病死率。准确快速地确定感染源头对于防控传染病疫情扩散非常重要，但是由于H7N9聚集性疫情中二代病例除了无保护条件下密切接触首发病例分泌物，病例还往往和首发病例有相同的活禽接触史或暴露于共同的活禽市场环境，很难确定二代病例的感染源头。从调查结果来看，苏州这两起H7N9聚集性疫情所涉及的病例没有共同的活禽或活禽市场接触史，但二代病例与首发病例均有密切接触史，从第二起疫情两例病例分离并测序的HA基因高度同源，这些证据都说明这两起聚集性疫情由人传人引起的可能性较大，因此必须高度关注可能的由于人传人引起的H7N9聚集性疫情，防止疫情蔓延。

从发病到首次使用奥司他韦等抗病毒药物治疗的时间间隔可能影响病例结局[13-14]。世界卫生组织推荐感染H7N9禽流感病毒疑似病例应尽早使用奥司他韦抗病毒治疗，其可有效减少疾病严重程度和死亡病例。而苏州两起聚集性疫情中涉及的4例H7N9病例结局不同(3例存活，1例死亡)，可能与首次使用奥司他韦等抗病毒治疗的时间不同有关。3例存活病例首次使用奥司他韦等抗病毒治疗的时间距发病均在72 h内，而死亡病例首次使用奥司他韦等抗病毒药物治疗距发病时间已经超过1周。此外，第二次疫情中死亡病例患有高血压可能也与病情加重有关。

禽流感病毒受体结合位点关键氨基酸发生突变(T160A、G186V、G226L及G228S)可使病毒能够有效结合人类受体[15-18]。序列分析表明同一起疫情中测得的H7N9病毒HA序列处在同一进化分支上，与候选疫苗株A/Anhui/1/2013相比，两起疫情中H7N9病毒受体结合位点关键氨基酸未发生改变，仍具有双受体结合能力。与广东和中国台湾等地发现的高致病性H7N9突变株不同[19-20]，HA切割位点未发现有多个碱性氨基酸(RKR)插入。NA蛋白未发生H276Y及R294K突变，提示早期使用奥司他韦等神经氨酸酶抑制剂类药物治疗H7N9病毒感染仍然有效。

综上所述，目前H7N9禽流感病毒不具备人际间持续传播的能力，H7N9患者临床症状、流行病学特征及药物敏感性也未发生明显改变。但是，密切监测分析H7N9病毒可能发生适应人类的突变仍然十分必要。