曹新芳，黄卉卉，任秋楠，陈婷婷，王静，张盛周

(安徽师范大学生命科学学院，安徽省重要生物资源保护与利用重点实验室，芜湖 241000)

泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）别称鱼鳅、泥鳅鱼，隶属鲤形目鳅科泥鳅属，常栖息于湖泊、池塘、水田的淤泥表层或缓流水中，繁殖速度快，适应性强，是一种杂食性小型鱼类，主要摄食水生昆虫、甲壳类、幼螺等底栖无脊椎动物和各种藻类、植物碎片等[1,2]。泥鳅肉质鲜美，具有很高的营养价值和补气养肾等药用价值，其蛋白降解产物还具有抗氧化作用，深受人们的喜爱，有“水中之参”的美称[2,3]。

近年来，随着泥鳅的市场需求量不断增加，人们对泥鳅的人工养殖技术及其相关基础理论的研究也在不断深入开展。刘孝华等[2]对泥鳅的生物学特性和人工养殖方法进行了描述和研究；胡廷尖等[4]通过组织学切片和显微观察研究了泥鳅消化道的形态特征和组织结构；陈苏维等[5]采用生物化学方法检测了泥鳅消化道不同部位淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的活力。然而，泥鳅消化道黏膜中与消化吸收相关的重要酶，如过氧化物酶（POX）、三磷酸腺苷酶（ATPase）、琥珀酸脱氢酶（SDH）、碱性磷酸酶（ALP）、酸性磷酸酶（ACP）和非特异性酯酶（NSE）等的活力尚未见研究报道。本文采用酶组织化学染色对泥鳅消化道黏膜中该6种重要酶的分布及组织定位进行研究，旨在增进对泥鳅消化生理功能的认识，为其人工养殖提供基础资料。

材料和方法

1 实验材料

鲜活人工养殖泥鳅9条，长15.4～18.6cm，重45.8～49.1g，购自芜湖市黄山西路菜市场，置于清水中暂养2h。用钝器敲打其头部致晕，快速解剖取出完整消化道，在泥鳅消化道的食道、胃贲门、胃体、胃幽门、前肠、中肠、后肠等7个部位进行精确分离取样，样品于0.01mol/L磷酸缓冲液（PBS）中漂洗干净后，OCT包埋，进行冷冻切片，厚度为8μm，置于-20 ℃冰箱中备用。

2 酶组织化学染色

6种酶的组织化学染色方法及酶反应的底物见表1，药品试剂的配制及实验操作步骤参考谢毓玲等[6]的方法进行。

表1 6种酶的组织化学染色方法和主要底物Tab.1 Histochemical staining techniques and main substrates of the 6 enzymes

3 光密度测定与数据分析

使用Olympus BX61型显微镜观察酶的组织化学染色结果并拍照。利用Image-Pro Plus图像分析软件，对酶组织化学染色的阳性部位进行光密度分析，测出面积（Area）和累积光密度值（IOD），并计算出平均光密度（MOD）值表示酶活力大小。在SPSS软件中，采用单因素方差分析（One-way ANOVN）法，分别对6种酶在消化道不同部位的活力进行两两比较，得出不同酶在泥鳅消化道不同部位分布的差异显著性，P＜0.05为差异显著。

结 果

在光镜下，经组织化学染色后，泥鳅消化道黏膜6种酶均呈现出明显的染色反应。对组织化学染色结果进行光密度测定和统计学分析，得出6种酶在泥鳅消化道不同部位的活力分布（表2)。

表2 泥鳅消化道黏膜6种重要酶的分布Tab. 2 Distribution of the 6 essential enzymes in the digestive mucosa of Misgurnus anguillicaudatus

过氧化物酶：POX组织化学染色阳性部位呈棕褐色，颗粒状分布。POX在食道中酶活性最高，在消化道的其余部位酶活性显著较低(表2）。POX在食道中主要分布于黏膜上皮细胞中（图A1）；在胃贲门、胃体和胃幽门中主要分布于黏膜上皮细胞基部；在肠道中主要分布于黏膜上皮细胞基部，固有层也有少量零星分布（图A2）。

三磷酸腺苷酶：ATPase组织化学染色阳性部位呈棕黑色。ATPase在胃贲门、胃体、胃幽门、前肠、中肠和后肠中酶活性较高，在食道中酶活性显著较低（表2）。ATPase在食道中主要分布于黏膜上皮细胞顶部；在胃贲门、胃体和胃幽门中集中分布于黏膜上皮细胞顶部（图B1）；在前肠、中肠和后肠中主要分布于黏膜上皮细胞的纹状缘，上皮细胞的基部亦可见少量分布（图B2）。

琥珀酸脱氢酶：SDH组织化学染色阳性部位呈蓝紫色。SDH在胃贲门、胃体、胃幽门、前肠、中肠和后肠中酶活性较高，在食道中酶活性显著降低（表2）。SDH在食道中主要分布于黏膜上皮细胞顶部；在胃贲门、胃体和胃幽门中主要分于胃小凹黏膜上皮细胞顶部，上皮细胞基部亦有少量分布（图C1）；在前肠、中肠和后肠中集中分布于黏膜上皮细胞顶部，部分上皮细胞基部亦有少量分布（图C2）。

碱性磷酸酶：ALP组织化学染色阳性部位呈深蓝色。ALP在胃贲门、胃体、胃幽门、前肠、中肠和后肠中酶活性较高，在食道中酶活性显著较低（表2）。ALP在食道中主要分布于黏膜上皮细胞顶部；在胃贲门、胃体和胃幽门中集中分布于黏膜上皮细胞的顶部（图D1）；在前肠、中肠和后肠中集中分布于黏膜上皮细胞的纹状缘（图D2）。

酸性磷酸酶：ACP组织化学染色阳性部位呈棕黄色。ACP在食道、胃贲门、胃体、前肠、中肠和后肠中酶活性较高，在胃幽门中酶活性显著较低（表2）。ACP在食道中主要分布于黏膜上皮细胞中；在胃贲门、胃体和胃幽门中主要分布于黏膜上皮细胞中，固有层中亦有少量分布（图E1）；在前肠、中肠和后肠中主要分布于黏膜上皮细胞顶部，固有层亦有少量分布（图E2）。

非特异性酯酶：NSE组织化学染色阳性部位呈砖红色。NSE在食道、胃贲门、胃幽门、前肠、中肠中酶活性较高，在胃体和后肠中酶活性显著降低（表2）。NSE在食道中主要分布于黏膜上皮细胞的顶部和基部；在胃贲门、胃体和胃幽门中主要分布于黏膜上皮细胞顶部和基底部，固有层亦有少量分布（图F1）；在前肠、中肠和后肠中主要分布于黏膜上皮细胞的纹状缘，上皮细胞基部和固有层中亦有少量分布（图F2）。

图1 泥鳅消化道黏膜6种酶的组织化学定位。A，POX在食道（A1）和后肠（A2）的分布；B，ATPase在胃体（B1）和后肠（B2）的分布；C，SDH在胃体（C1）和中肠（C2）的分布；D，ALP在胃体（D1）和前肠（D2）的分布；E，ACP在胃幽门（E1）和中肠（E2）的分布；F，NSE在胃幽门（F1）和后肠（F2）的分布；SB，纹状缘；ME，黏膜上皮；LP，固有层；GP，胃小凹；比例尺，50μmFig. 1 Histochemical localization of 6 enzymes in digestive tract mucosa of Misgurnus anguillicaudatus. A, distribution of POX in the esophagus (A1)and hindgut (A2); B, distribution of ATPase in the stomach corpus (B1) and hindgut (B2); C, distribution of SDH in the stomach corpus (C1) and midgut (C2); D, distribution of ALP in the stomach corpus (D1) and foregut (D2); E, distribution of ACP in the stomach pylorus (E1) and midgut (E2); F,distribution of NSE in the stomach pylorus (F1) and hindgut (F2); SB, striated border; ME, mucosal epithelia; LP, lamina propria; GP, gastric pit; scale bar, 50μm

讨 论

泥鳅的消化道由食道、胃、前肠、中肠和后肠组成。泥鳅的胃不十分明显，由肠管膨大形成，呈直管状，无弯曲，属“I”型胃[4]。本研究显示，泥鳅胃没有明显的胃腺，POX、ATPase、SDH和ALP的酶活性在胃和肠道之间没有显著差异性，进一步表明，泥鳅的胃分化程度较低，其黏膜的组织结构和酶组成与肠黏膜有较高的相似性。

POX是广泛存在于微生物、动植物体内的一种氧化还原酶，具有消除细胞内有毒代谢产物如过氧化氢、醛类、酚类、胺类等物质的作用[7,8]。本研究显示，POX主要分布于泥鳅消化道的食道，在胃和肠道中分布较少。与乌鳢（Ophiocephalus argus）[6]消化道中POX主要分布于胃贲门和胃体，食道中分布较少，存在明显差异；与鳜鱼（Siniperca chuatsi）[9]消化道中POX在肠道中分布较少相似，但鳜鱼胃幽门中POX分布最多，食道中分布较少。泥鳅食道中较高的POX酶活性有利于清除食道中因频繁吞咽活动产生的较多有毒代谢废物。POX发挥催化作用释放的氧自由基还具有杀灭病原微生物的作用[10]，因此，POX在泥鳅食道中分布较多还有利于防止外来病原微生物侵入机体，可能是机体的一种保护机制。

ATPase是普遍存在于细胞膜和线粒体、溶酶体等细胞器膜上的一类水解酶，能够水解ATP并释放能量，参与营养物质的吸收和胞内物质的转运[11]。本研究显示，ATPase主要分布于泥鳅消化道的胃贲门、胃体、胃幽门、前肠、中肠和后肠，在食道中酶活性显著较低。与乌鳢[6]消化道中ATPase的分布明显不同，主要分布于乌鳢胃体，其次为胃幽门和胃贲门，在肠道中分布相对较少；鳜鱼[9]消化道中ATPase主要分布于食道、胃贲门、胃体、胃幽门、前肠和后肠，在中肠分布最少,与 泥鳅消化道ATPase的分布亦存在差异。乌鳢和鳜鱼胃中ATPase活性较高主要是由于其胃腺发达， ATPase集中分布于胃腺，黏膜上皮细胞中分布较少，主要为胃蛋白酶和胃酸的分泌提供能量；泥鳅胃黏膜无明显的胃腺，ATPase集中分布于黏膜上皮细胞顶部，与肠道中ATPase主要分布于上皮细胞的纹状缘相似，表明泥鳅的胃上皮细胞可能具有较强的吸收功能，泥鳅的胃和肠道均是营养物质的吸收部位。

SDH广泛存在于线粒体内膜，是线粒体的一种标志酶，参与并催化三羧酸循环中琥珀酸还原为延胡索酸，酶活性可用于判断三羧酸循环的强度[12]。本研究发现，SDH在泥鳅的胃和肠道各段均分布较多，在食道中分布最少。与乌鳢[6]和鳜鱼[9]消化道中SDH主要分布于胃贲门和胃体，在肠道分布较少存在显著差异，但与两者食道中SDH分布最少相似。乌鳢和鳜鱼胃腺发达，SDH集中分布于胃腺，为胃腺的分泌活动提供足够的能量。泥鳅没有明显的胃腺，胃中SDH集中分布于黏膜上皮细胞顶部，与肠道中SDH的分布相一致，可为胃和肠道上皮细胞吸收营养物质提供充足的ATP能量。

ALP主要存在于细胞膜中，参与营养物质如脂质、糖类、钙和无机磷酸盐的吸收，可根据其分布来判断鱼类消化道中营养物质吸收的主要部位[13,14]。本研究显示，ALP在泥鳅的胃和肠道各部位活性均较高，在食道中酶活性显著较低。与乌鳢[6]消化道中ALP主要分布于前肠和中肠，胃贲门、胃体和胃幽门分布较少不同；与许氏平鲉（Sebastes schlegelii）[15]消化道中ALP主要分布于中肠，前肠和后肠分布相对较少，食道、胃贲门和胃幽门未检测到酶活性存在显著差异；与半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）[8]消化道中ALP主要分布于前肠，其次为后肠，胃中分布最少亦明显不同。泥鳅消化道中ALP主要定位于胃黏膜上皮细胞顶部和肠上皮细胞的纹状缘，进一步表明泥鳅的胃和肠道都是营养物质的吸收部位。

ACP是存在于溶酶体的一种标志酶，主要参与细胞内蛋白质的消化和吸收。通过胞饮作用直接吸收蛋白颗粒然后进行细胞内消化被认为是硬骨鱼中蛋白质消化的另一种途径[16]。本研究显示，ACP在泥鳅的食道、胃贲门、胃体、前肠、中肠和后肠中酶活性较高，胃幽门中酶活性显著较低。与褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）[17]消化道中ACP主要分布于中肠，其次为食道、胃体、前肠和后肠，在胃贲门和胃幽门分布最少相似；与许氏平鲉[15]消化道中ACP在后肠和中肠中分布较多，前肠和胃贲门中相对较少，食道和胃幽门中分布最少存在不同之处；与乌鳢[6]消化道中ACP在中肠和后肠分布最高，其次为胃幽门和前肠，在胃贲门、胃体和食道分布最少则明显不同。由此可见，ACP在鱼类消化道各段的分布具有一定的物种特异性。泥鳅消化道ACP的分布表明其胃贲门、胃体和前肠具有较强的蛋白质吸收和细胞内消化功能。

NSE参与包括鱼类在内的大多数脊椎动物中脂肪酸甘油酯的水解，与脂质的消化和吸收有关。由于鱼类的能源物质主要是脂质而不是碳水化合物和蛋白质，因此，NSE对鱼类获取能源物质尤为重要[13,18]。本研究显示，NSE在泥鳅的食道、胃贲门、胃幽门、前肠、中肠中活性均较高，在胃体和后肠中分布较少。与项带重牙鲷（Diplodus vulgaris）[19]消化道中NSE主要分布于前肠和中肠，在后肠分布最少相似；但与褐菖鲉[17]消化道中NSE在胃幽门中分布最高，其次为胃贲门、胃体，在食道和肠道中分布最少存在显著差异；与红娘鱼（Lepidotrigla Cavillone）[20]消化道中NSE在后肠分布最多，其次为前肠，在幽门盲囊和中肠分布最少亦明显不同。泥鳅消化道中NSE分布较为广泛，食道、胃贲门、胃幽门和前肠中检测到较高的酶活性，表明泥鳅消化道的前段就有较强的脂质消化功能，这与鱼类以脂质为主要能源物质相适应。

综上所述，泥鳅消化道黏膜6种酶的分布同其他鱼类相比，显示出明显的物种特异性，主要表现为泥鳅胃分化程度低，酶的分布和定位与肠道较为相似。本研究表明，泥鳅的胃和肠都有较强的吸收功能；胃贲门、胃体和前肠具有较强的蛋白质吸收和细胞内消化功能；胃贲门、胃幽门、前肠和中肠具有较强的脂质消化能力。