林高城 陈云欢 杨莉惠 陈雨 邹愉龙 余友金

动脉粥样硬化（As） 是一种由血脂代谢紊乱和血管慢性炎症共同作用而形成的疾病，单核/巨噬细胞系统在AS形成中扮演着重要的角色[1]。在高脂血症状态下，为了清除局部组织和血液系统中过多的脂质，全身单核/巨噬细胞被激活，大量增生并摄取氧化型低密度脂蛋白从而转化为泡沫细胞，分泌大量的炎症因子如IL-1β、TNF-α、IL-6，加重局部炎症反应。泽泻汤具有降脂、利水、抗动脉粥样硬化等药理作用[2]。本文在张仲景《金匮要略》记载的泽泻、白术5：2配伍比例的基础上设计了 1：1、2：5组，来对比研究泽泻汤的降血脂以及抑制炎症因子表达的作用，探讨配伍比例对泽泻汤降血脂及抗炎症因子作用的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

TNF-α、IL-6购自于武汉博士德生物科技有限公司，脂多糖为Sigma公司，台盼蓝染色液购于solarbio公司，PBS缓冲液、1640培养基购自Hyclone有限公司，SD大鼠（雄性）40只，购自福建医科大学实验动物中心（许可证号：SCXK（闽）2012-0001），Leica DM IL LED 倒置显微镜，细胞培养箱（ Therom 公司，美国） 等。

1.2 实验动物及分组

SD大鼠40只，体质量160～260 g，购自福建医科大学实验动物中心,根据随机数字表将大鼠随机分为正常对照组、高脂血症组、A组、B组，C组，每组8只，饲养于SPF动物实验室，室温25℃、湿度 45%～65% ，喂食标准饲料。实验时间为2015～2017年。

1.3 泽泻汤的制备

泽泻、白术均购自于福建中医药大学附属康复医院，参考中药药理实验方法学（上海科学技术出版社，李仪奎著）制备相当于生药材2.64 g/ml的药液：第一煎加水量约为总药量的6倍，浸泡1 h，煎煮大概 20 min；第二煎加水量约为总药量的4倍，煎0.5 h，两次药液混合后，再浓煎压缩，4℃冰箱储存备用。

1.4 动物造模

正常对照组SD大鼠用普通大鼠饲料常规喂养，高脂血症组、A组、B组、C组均用大鼠高脂饲料（即猪油10%，丙基硫氧嘧啶0.2%，胆固醇1%，脱氧胆酸钠0.5%，蛋黄粉5%，蔗糖5%，基础饲料78.3%，配方参照王琼等[3]的研究）喂养，A、B、C组在给予高脂饮食喂养的同时给予相对应的泽泻汤灌胃，按1 ml/100 g灌胃给药，A组：泽泻：白术＝5：2， B组：泽泻：白术＝1：1，C组，泽泻：白术＝2：5；每天2次，连续20 d，正常对照组及高脂血症组给予等量生理盐水灌胃。

1.5 血脂检测

5组大鼠在干预第20日后，均禁食不禁水12 h，经大鼠眼眶取血，根据各指标试剂盒说明书，检测血浆中TC、TG、LDL-C含量。

1.6 大鼠腹腔巨噬细胞提取及细胞培养

借鉴兰青等[4]办法提取大鼠腹腔巨噬细胞，详细方法如下：颈椎脱臼处死大鼠，手抓大鼠尾部将其浸入70%乙醇中，浸泡5～8 min后，从大鼠腹腔一侧近45°角刺入腹腔，注射 1 640培养液 35～50 ml，在工作台上打开大鼠腹腔，吸取其腹腔液约10 ml，1 200 r/min 离心8 min。去掉上清液后，留下离心管底部乳白色沉淀物，台盼蓝染色显示细胞存活率＞95%。

1.7 脂多糖干预及炎症因子测定

各组大鼠腹腔巨噬细胞培养24 h后，吸去上清液，加入脂多糖（ 10 mg /L）继续培养24 h，之后进行TNF-α及IL-6的检测。EILSA法检测IL-6和 TNF-α浓度。操作步骤按说明书进行。均在450 nm波长读取OD值，绘制出标准曲线自动计算IL-6和TNF-α浓度。

1.8 统计学方法

所有数据采用SPSS 17. 0 统计软件进行处理，实验数据以（）表示，组间差异比较用F检验及独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同配伍泽泻汤对高脂血症大鼠血脂水平的影响

与正常对照组比较，高脂血症组大鼠血清TC、TG、LDL-C明显上升（P＜0.05），说明建立模型成功；A组、B组、C组的TC、LDL-C 的水平均显著低于高脂血症组（P＜0.05）,但高脂血症组与泽泻汤不同比例配伍组的TG比较变化不显著（P＞0.05），说明不同配伍比例的泽泻汤组都具有明显的降低TC、LDL-C作用。A组、B组的TC、LDL-C的水平均明显小于C组（P＜0.05），且A组降脂幅度更优于B组（P＜0.05），说明泽泻：白术＝5：2在降血脂方面有明显优势。见表1。

2.2 各组大鼠巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6 表达的影响

与正常对照组比较，高脂血症组TNF-α、IL-6 表达均增加显著（P＜0. 05）；与高脂血症组比较，A组、B组、C组TNF-α、IL-6 表达均明显下降（P＜0. 05）；A组、B组TNF-α、IL-6 表达均明显小于C组（P＜0. 05）；且以A组下降更为显著（P＜0.05）。见表2。

3 讨论

现代药理学研究表明泽泻含有重要降血脂作用的成分为三萜类化合物，这种化合物主要有泽泻醇 A、泽泻醇 B、24-乙酰泽泻醇A等。研究发现泽泻醇 B 能影响血管平滑肌细胞，发挥泽泻治疗动脉粥样硬化的作用[5]，24-乙酰泽泻醇A 不仅能抑制巨噬细胞、平滑肌细胞炎症反应而且还能抑制平滑肌细胞迁移、表型转化，改善泡沫细胞脂质累积等作用[6-7]。炒白术有比较显著抗脂质沉积及抗氧化作用，能增强人的免疫功能。从本实验结果观察，不同配伍比例的泽泻汤均能显著降低高脂血症大鼠血清中的 TC、LDL-C 水平，其中泽泻、白术按经典比例配伍即 5：2 降血脂效果最明显，配伍比例1：1 的降血脂作用次之，由此可见，配伍比例对泽泻汤降血脂作用有一定影响。

表1 各组大鼠血脂水平比较（mmol/L，±s）

表1 各组大鼠血脂水平比较（mmol/L，±s）

注：与正常对照组比较，；与高脂血症组比较；与泽泻汤 A 组比较

表2 各组大鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α及IL-6 表达比较（ng/L，）

表2 各组大鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α及IL-6 表达比较（ng/L，）

注：与正常对照组比较，；与高脂血症组比较；与泽泻汤 A组比较

已有研究表明高脂血症可促进巨噬细胞形成泡沫细胞[8]，经过LPS刺激后巨噬细胞可分泌大量的炎症因子[9]如TNF-α、IL-1β、IL-6加重局部病灶的炎症反应。肿瘤坏死因子α通过促进血栓形成，诱导血管内皮细胞坏死、新生微小血管形成从而促进AS发生，在AS形成病理学方面，不管是在动脉发生内膜增生还是内皮功能紊乱的过程中，TNF-α都扮演着重要作用[10-12]。TNF-α和IL-6通过抑制ATP结合盒转运子抑制巨噬细胞内胆固醇排出[13]，白介素6可上调巨噬细胞低密度脂蛋白受体表达，促进巨噬细胞吞噬更多的低密度脂蛋白，加速脂质沉积在血管壁上从而形成动脉斑块,白介素6还可通过刺激巨噬细胞分泌单核细胞趋化蛋白（MCP-1），MCP-1可促使单核-巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞聚集于血管内皮引起炎症反应[14]。

本实验通过较长时间的高脂饮食喂养，成功建立高脂血症模型，研究发现，高脂血症组巨噬细胞分泌的TNF-α和IL-6的表达较正常对照组显著增加，提示高脂血症大鼠处于慢性炎性反应状态，TNF-α和IL-6协同参与了动脉粥样的形成，经泽泻汤治疗后的大鼠腹腔巨噬细胞分泌的TNF-α和IL-6明显减少，尤其是经典泽泻汤配伍A组下降最明显。泽泻汤可通过影响炎症因子与血脂代谢改善大鼠机体慢性炎症状态，然而这一过程涉及的机制十分复杂，尚需更深入的研究与探索。