杨永超,王中元,杨小振,王永琦,3,张 宇,张 显

(1 西北农林科技大学 园艺学院，陕西 杨凌 712100；2 文山州农业科学院，云南 文山 663099；3 汉中市农业技术推广中心，陕西 汉中 723000)

植物在经受干旱、盐、低温及重金属等胁迫时会在体内合成和积累脯氨酸。脯氨酸除了作为渗透调节物质参与植物的渗透调节外，还在稳定亚细胞结构、清除自由基、维持细胞内氧化-还原平衡、缓冲细胞质pH、作为信号分子参与胁迫响应及生长发育、保持和代谢相适应的NADP+/NADPH等方面发挥作用[1]。在植物中，脯氨酸合成途径有2条，即谷氨酸途径和鸟氨酸途径[2]。在谷氨酸途径中，谷氨酸在Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)作用下还原为谷氨酰半醛(GSA)，然后GSA环化转变为P5C，最后在吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)作用下生成脯氨酸。多数情况下，植物在胁迫条件下主要以谷氨酸途径合成脯氨酸[3]。

P5CS是谷氨酸合成途径中的限速酶，在脯氨酸合成和积累过程中发挥着重要作用[4]。通常植物中有2个P5CS基因。在拟南芥中，AtP5CS由AtP5CS1和AtP5CS2编码，二者内含子的相似性为39%～65%，而且这2个基因在功能上并不冗余[5]。在水稻中，OsP5CS1和OsP5CS2均能被干旱和盐胁迫诱导表达；敲除OsP5CS2的突变体水稻植株对盐和低温胁迫敏感，但在正常生长条件下，突变株能正常生长和结籽，其产量减少不显著，这说明OsP5CS2的主要角色为响应胁迫而不参与基础的脯氨酸合成[6]。在甜高粱中，2个SbP5CS的启动子中都含有与胁迫响应相关的顺式作用元件，如ABRE、MYCCONSENSUSAT、MYBCORE、MeJA-responsive motif等。虽然有相似的顺式元件，但SbP5CS1和SbP5CS2的表达量却不同，在盐和干旱胁迫下，SbP5CS1的表达量高于SbP5CS2，这可能与启动子被调控的时间和空间不一致有关[7]。

P5CS基因受胁迫诱导表达的同时伴随脯氨酸含量增加，这显示了P5CS基因在作物改良中的潜力。Su等[8]将VignaaconitifoliaL.(一种豆科植物)的P5CS编码序列转入水稻发现，组成性表达和诱导性表达P5CS基因的转基因水稻植株的P5CS表达量及脯氨酸含量均比野生型植株高；在盐和干旱胁迫下，转基因水稻苗幼芽和根的生长均快于野生型水稻，且诱导性表达转基因植株的生物产量高于组成性表达转基因植株。Yamada等[9]将拟南芥和水稻的P5CS基因转入牵牛花中，在正常生长条件下转基因植株脯氨酸含量比野生型植株提高了1.5～2.6倍，且拥有更强的抗旱能力。Yamchi等[10]将拟南芥的AtP5CS转入烟草中，转基因烟草受干旱胁迫后其体内的脯氨酸积累量高于非转基因植株，并表现出较强的抗旱及抗盐特性。

M08是一个相对抗旱的西瓜自交系[11]，前期转录组测序发现，渗透胁迫下M08的2个P5CS基因在根中的表达模式不同[12]。目前针对西瓜ClP5CS基因的研究尚未见报道，因此本研究克隆了西瓜2个ClP5CS基因(Cla017928和Cla006553)，并将其转入拟南芥中，研究其抗旱抗盐的功能，以期为抗旱耐盐西瓜新品种的培育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

西瓜自交系M08种子经质量分数2%的次氯酸钠消毒10 min，再经过55 ℃温汤浸种20 min，浸种8 h后于30 ℃下催芽，种子露白后播于营养钵中，并置于日光温室中培养。待2叶1心时控水进行干旱胁迫，植株出现蔫萎时取幼叶用于总RNA的提取。

基础培养基：MS培养基(MS粉4.33 g/L、蔗糖20 g/L、琼脂粉8 g/L)，LB培养基(胰化蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L)。大肠杆菌液体培养基：LB+50 mg/L卡那霉素；大肠杆菌固体培养基：LB+100 mg/L氨苄青霉素+15 g/L琼脂粉；蓝白斑筛选培养基：LB+100 mg/L氨苄青霉素+24 μg/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)+40 μg/L 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)+15 g/L琼脂粉;农杆菌固体培养基：LB+50 mg/L利福平+50 mg/L硫酸卡那霉素+50 mg/L庆大霉素+15 g/L琼脂粉；农杆菌液体培养基：LB+50 mg/L利福平+50 mg/L硫酸卡那霉素；拟南芥阳性苗筛选培养基：MS+50 mg/L硫酸卡那霉素。

RNA PlantPlus Reagent试剂盒、EasyGeno快速重组克隆试剂盒、大肠杆菌感受态TOP10、反转录用FastQuant RT Kit(with gDAase)和2×TaqPCR MasterMix，均购自北京天根生化科技有限公司；高保真酶PrimeSTAR MAX Premix(2×)、克隆载体pMD-19T,均购自TaKaRa公司；EcoRⅠ、Hind Ⅲ，购自美国Thermo Fisher Scientific公司；IPTG、X-Gal、利福平、氨苄青霉素、庆大霉素、卡那霉素，均购自Solarbio公司；Silwet L-77、MS粉、琼脂、蔗糖、酵母提取物、胰化蛋白胨、氯化钠、甘露醇、脱落酸(ABA)等，均购自上海源叶生物科技有限公司；GV3101菌株、野生型拟南芥(Columbia生态型)及pBI221、pCAMBIA2300载体，均由西北农林科技大学瓜类种质创新与遗传改良实验室保存。引物合成及克隆产物测序由上海生工生物完成。

1.2 方 法

1.2.1Cla017928及Cla006553的克隆及过表达载体构建 用RNA PlantPlus Reagent试剂盒提取叶片总RNA，采用FastQuant RT Kit (with gDAase)进行反转录得到cDNA，-20 ℃保存备用。

将拟南芥AtP5CS1和AtP5CS2序列与西瓜基因组进行比对，发现其分别与西瓜Cla006553及Cla017928序列相近。以Cla017928及Cla006553的CDS序列为模板，设计引物Cla017928 CDS和Cla006553 CDS(表1)。Cla017928及Cla006553的CDS序列克隆体系为：高保真酶PrimeSTAR MAX Premix(2×) 25 μL，上下游引物各2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 22 μL。反应条件为：98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s共30个循环。将PCR产物电泳并回收，在序列的3端添加A碱基后连接pMD-19T克隆载体，蓝白斑筛选后进行菌落PCR，每个序列挑5个阳性菌株测序，同时提取质粒。

将pCAMBIA2300载体使用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，电泳回收大片段。使用特异引物(35GN-23)克隆pBI221上的35S-GFP-NOS序列，并连接到线性化的pCAMBIA2300载体，构建中间载体pCAMBIA2300-GFP。用XbaⅠ、KpnⅠ双酶切将pCAMBIA2300-GFP线性化，电泳回收大片段备用。

以测序后的克隆载体为模板，用C9-23a和C5-23a引物扩增Cla017928及Cla006553序列，反应体系同上。产物经电泳回收后，与线性化的pCAMBIA2300-GFP进行重组连接，构建Cla017928-GFP和Cla006553-GFP过表达载体。过表达载体结构如图1所示。重组连接采用EasyGeno快速重组克隆试剂盒进行，反应体系为：线性化载体1 μL，目的序列4 μL，2×EasyGeno Assembly Mix 5 μL，ddH2O 10 μL，将混合物于50 ℃反应15 min。将获得的表达载体转化大肠杆菌，涂布于含卡那霉素的LB固体平板上，12 h后挑单菌落进行PCR检测，挑选阳性菌落测序。

表1 试验所用引物的序列及信息Table 1 Sequences and information of primers used for cloning in this study

将获得的2个ClP5CS与拟南芥AtP5CS1、AtP5CS2(GenBank登录号分别为：NM_129539、NM_115419.4)进行比对和保守功能域预测。利用MEGA 5.0构建系统进化树。

Ⅰ.中间载体;Ⅱ.Cla017928-GFP或Cla006553-GFP过表达载体Ⅰ .Indicates transitional vector；Ⅱ.Over expression vector for Cla017928-GFP or Cla006553-GFP图1 Cla017928和Cla006553过表达载体结构Fig.1 Overexpression vector construction of Cla017928 or Cla006553

1.2.2 过表达载体的农杆菌转化 将测序正确的中间载体及Cla006553-GFP和Cla017928-GFP过表达载体通过冻融法转入感受态农杆菌(GV3101菌株)中。具体方法为：向50 μL感受态农杆菌中加入5 μL目的质粒，混匀后于冰上静置30 min，然后在液氮中速冻3 min，28 ℃水浴5 min，最后加入1 mL的LB液体培养基28 ℃振荡培养5 h。取60 μL上述菌液涂布含利福平(50 mg/L)、庆大霉素(50 mg/L)和卡那霉素(50 mg/L)的LB固体培养基上，培养24～72 h后挑取单菌落进行PCR检测，阳性菌液加甘油(最终质量分数25%)于-80 ℃保存。

1.2.3 农杆菌侵染拟南芥及阳性植株筛选 将野生型拟南芥(Columbia生态型)种子放在铺有润湿滤纸的培养皿中，放入4 ℃冰箱中春化2 d后播种于营养钵中，基质为市售育苗基质。播种后覆盖保鲜膜至15 d后揭去。苗期培养条件为：22 ℃下光照10 h/20 ℃下黑暗14 h。3～4周后培养条件调为：22 ℃下光照16 h/20 ℃下黑暗8 h，以促进拟南芥开花。待拟南芥大量开花时参考Zhang等[13]的方法将农杆菌侵染拟南芥，步骤为：将含有目的质粒的农杆菌加入500 mL含卡那霉素(50 mg/L)和庆大霉素(50 mg/L)的LB液体培养基中，28 ℃、200 r/min培养16～24 h，待菌液在600 nm处吸光度(D600 nm)为1.5～2.0，于室温下4 000g离心10 min，然后用500 mL新配制质量分数为5%的蔗糖溶液重悬农杆菌，加入100 μL的Silwet L-77表面活性剂(最终体积分数为0.02%)，立刻混匀。将拟南芥已开的花除去，然后倒转营养钵，将拟南芥花序浸没于农杆菌悬浮液中10 s，在此过程中轻轻搅动。使用保鲜袋将浸过农杆菌的拟南芥植株罩住，平放，在较低的光照条件下于22 ℃培养16～24 h后，揭去保鲜袋，放入培养室中正常培养。每隔6 d浸染1次，共浸染3次。1个月后收种子(即T0代种子)，并将T0代种子播种于含卡那霉素的MS培养基上筛选转基因阳性苗，同时分别以植株的DNA和cDNA为模板进行DNA-PCR和RT-PCR检测阳性苗，PCR反应体系为：2×TaqPCR MasterMix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA/cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反应条件为：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，共30个循环。按照此方法筛选直到T2代，分析分离比，确定纯合转基因拟南芥植株，选择纯合的T2代种子进行下一步试验。

1.2.4 转基因拟南芥植株的抗渗透胁迫能力 种子发芽率试验：将转基因T2代及野生型拟南芥种子播于含不同浓度NaCl(150，250 mmol/L)和甘露醇(150，300 mmol/L)的MS培养基上，以MS固体培养基上培养的种子为对照，春化2 d后放入光照培养箱中，培养条件为光照16 h，黑暗8 h，温度22 ℃。10 d后统计不同渗透胁迫处理对种子相对发芽率的影响。以野生型为对照。发芽率统计参照陈吉宝等[14]的方法，即相对发芽率=处理发芽率/对照发芽率×100%。

苗期渗透胁迫试验：将转基因T2代和野生型拟南芥种子播于MS培养基上，6 d后转移到含不同浓度脱落酸(25，50 μmol/L)、甘露醇(150，250 mmol/L)和NaCl(100，150 mmol/L)的MS培养基上，培养6 d后统计根长，拍照。

苗期NaCl及干旱胁迫试验：当营养钵中的转基因及野生型拟南芥植株长至4片真叶时进行干旱和盐胁迫处理，盐胁迫处理每隔4 d浇300 mmol/L NaCl溶液1次，处理15 d后调查成活率；干旱胁迫处理采用自然干旱的方式进行，处理20 d后复水，2 d后统计成活率。每个株系每处理12株，重复3次。待植株出现蔫萎(干旱处理)和叶片发黄(盐处理)时，按照陈吉宝等[14]的方法检测各处理的脯氨酸含量。以正常培养的拟南芥为对照。

2 结果与分析

2.1 西瓜ClP5CS基因CDS序列的克隆

本试验从西瓜幼叶cDNA中扩增出目的条带Cla006553和Cla017928 CDS序列(图2)，经测序和拼接，Cla006553序列长2 166 bp，编码721个氨基酸；Cla017928序列长2 145 bp，编码714个氨基酸。二者核苷酸和氨基酸序列相似性分别为74.19%和77.12%。Cla006553及Cla017928 CDS序列与西瓜基因组数据库中相对应的基因相似性分别为93.06%和96.64%。2个基因序列及氨基酸序列见图3和图4。

1.Cla006553的CDS序列；2.Cla017928的CDS序列；M.DNA Marker1.Coding sequence of Cla006553;2.Coding sequence of Cla017928;M.DNA Marker图2 西瓜Cla006553和Cla017928 CDS序列的克隆Fig.2 Coding sequence of Cla006553 and Cla017928

图3 西瓜Cla006553 CDS序列及推定的氨基酸序列Fig.3 Coding sequence of Cla006553 and its putative amino acids sequence

图4 西瓜Cla017928 CDS序列及推定的氨基酸序列Fig.4 Coding sequence of Cla017928 and its putative amino acids sequence

将2个ClP5CS与拟南芥AtP5CS1(GenBank登录号:AY150430.1)和AtP5CS2(GenBank登录号:Y09355.1)进行比对分析，结果(图5)发现各P5CS氨基酸序列长度相近，而且都包含ATP结合位点、亮氨酸拉链、谷氨酰激酶结构域、NAD(P)H结合位点、亮氨酸结构域、谷氨酸半醛脱氢酶结构域等保守功能域。在2个ClP5CS的129位点上均为苯丙氨酸(图5中箭头处)，此位点是脯氨酸反馈抑制位点。

系统进化分析结果(图6)发现，选定物种的P5CS可以依据单子叶植物和双子叶植物分为两类，其中Cla006553与甜瓜CmP5CS关系较近，而Cla017928与黄瓜CsP5CS的关系较近。

2.2 转西瓜ClP5CS基因拟南芥阳性植株的筛选

以纯合的T2代种子供下一步试验,共获得23A株系2个(23A-1、23A-2)，转Cla006553和Cla017928的株系分别为4个(图7),即Cla006553-1～Cla006553-4和Cla017928-1～Cla017928-4。

黑色区域示完全相同的氨基酸残基，灰色区域示相似度在50%以上的氨基酸残基The black region represents the exactly same amino acid residues and the gray region represents more than 50% similarity图5 西瓜ClP5CS与拟南芥AtP5CS的氨基酸序列比对Fig.5 Comparison of ClP5CSs with AtP5CS

图6 不同植物P5CS的系统进化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of P5CS from different plants

A.DNA-PCR；B.RT-PCR。1～2.23A转基因株系；3～6.转Cla006553基因株系Cla006553-1、-2、-3、-4；7～10.转Cla017928基因株系Cla17928-1、-2、-3、-4；11.野生型拟南芥DNA(A图)和cDNA(B图)；12.空白对照；M.DNA MarkerA.DNA-PCR；B.RT-PCR.1-2.23A transgenic lines;3-6.Cla006553 transgenic lines Cla006553-1,-2,-3,-4;7-10.Cla017928 transgenic lines Cla017928-1,-2,-3,-4;11.DNA (Fig.A) and cDNA (Fig.B) of wild type Arabidopsis plants;12.Black control;M.DNA Marker

2.3 渗透胁迫下转西瓜ClP5CS基因拟南芥的发芽率检测

选取23A-1株系及2个Cla006553和Cla017928转基因株系(Cla006553-1，Cla006553-3，Cla017928-1，Cla017928-2)为研究材料，将其T2代及野生型拟南芥种子播于含NaCl和甘露醇的MS培养基上，研究转基因株系在渗透胁迫下的发芽率。结果表明，在250 mmol/L NaCl和300 mmol/L甘露醇上，野生型和转基因拟南芥均未发芽。在150 mmol/L NaCl和150 mmol/L甘露醇上，转Cla006553及Cla017928基因拟南芥的发芽率均显著高于野生型和23A-1植株，其中Cla017928-1株系在150 mmol/L甘露醇和Cla006553-3株系在150 mmol/L NaCl处理下，发芽率显著高于其他株系(图8)。

1～6分别代表野生型、23A-1、Cla006553-1、Cla006553-3、Cla017928-1及Cla017928-2拟南芥株系；图柱上标不同小写字母表示同一处理不同株系间差异显著(P<0.05)。下图同1-6 indicate wild type,23A-1,Cla006553-1,Cla006553-3,Cla017928-1,and Cla017928-2 Arabidopsis,respectively；Different lowercase letters mean significant difference (P<0.05).The same below

2.4 转西瓜ClP5CS基因拟南芥幼苗的抗渗透性鉴定

将T2代及野生型拟南芥种子播于MS培养基上发现，在MS培养基上转基因植株和野生型拟南芥均能正常生长。在含不同浓度脱落酸、甘露醇和NaCl的MS培养基上，转基因植株和野生型拟南芥的生长都受到了不同程度的抑制，抑制程度随浓度的增大而加剧。

对拟南芥植株的主根长度进行测量，结果(图9)发现，在各胁迫条件下，转ClP5CS基因拟南芥株系的根长均显著优于32A-1和野生型株系。在50 μmol/L脱落酸和250 mmol/L甘露醇处理下，Cla006553-1、Cla006553-3株系与Cla017928-1、Cla017928-2株系之间根长差异不明显；在150 mmol/L NaCl处理中，Cla006553-1与Cla006553-3株系根长差异显著。

图9 苗期渗透胁迫对野生型及转西瓜ClP5CS基因拟南芥根生长的影响Fig.9 Effects of various stresses on root length of WT and ClP5CS transgenic Arabidopsis

2.5 转西瓜ClP5CS基因拟南芥株系的耐盐耐旱能力检测

干旱处理和盐处理7 d后，拟南芥植株出现了蔫萎及发黄的现象。由图10可以看出，在CK中，转ClP5CS基因株系脯氨酸含量显著高于野生型及23A-1株系(P<0.05),其中含量最高的Cla017928-1株系分别是野生型和23A-1植株的2.6和2.9倍，并显著高于转Cla006553的2个株系(P<0.05)，另外Cla006553-3、Cla017928-1和Cla017928-2株系的脯氨酸含量均显著高于Cla006553-1株系。盐处理7 d后，转ClP5CS基因株系的脯氨酸含量高于野生型及23A-1株系，但各株系差异并不显著，同样的情况也发生在干旱处理中，这可能与P5CS的反馈抑制有关。

干旱处理20 d，参试的拟南芥植株均出现了严重蔫萎(图1)，复水2 d后，Cla006553-1、Cla006553-3、Cla017928-1、Cla017928-2、23A-1及野生型植株的存活率分别为54%，47%，39%，42%，23%和15%。300 mmol/L NaCl处理15 d的拟南芥生长明显被抑制，野生型和23A-1植株出现死亡(图12)，Cla006553-1、Cla006553-3、Cla017928-1、Cla017928-2、23A-1及野生型的平均存活率分别为71%，83%，87%，85%，21%和18%。

图10 野生型及转西瓜ClP5CS基因拟南芥植株体内脯氨酸的积累情况Fig.10 Accumulation of proline in WT and ClP5CS transgenic plants

图11 干旱胁迫下转西瓜ClP5CS基因拟南芥苗的生长情况Fig.11 Growth of ClP5CS transgenic and wild type Arabidopsis seedlings under drought stress

图12 300 mmol/L NaCl胁迫处理转西瓜ClP5CS基因拟南芥的生长情况Fig.12 Growth of ClP5CS transgenic and wild type Arabidopsis thaliana seedlings under 300 mmol/L NaCl stress

3 讨 论

脯氨酸作为重要的渗透调节物质、蛋白稳定剂和自由基清除剂，在植物抗逆中具有重要的作用[15]。P5CS是植物体内脯氨酸生物合成的关键酶，也是植物在遭受胁迫时脯氨酸合成的限速酶[16]。许多植物中有2个基因编码P5CS蛋白，如拟南芥[5]、水稻[6]等。P5CS酶是双功能酶，具有谷氨酰-γ-半醛脱氨酶和谷氨酸激酶活性，故其既能催化谷氨酸磷酸化为谷氨酸半醛，又能催化谷氨酸半醛还原[17]。本研究在西瓜自交系材料M08中，也克隆到了2个P5CS基因，即Cla006553和Cla017928，其核酸序列长度分别为2 166和2 145 bp，编码721和714个氨基酸。经保守结构域分析，这2个酶中都包含ATP结合位点、亮氨酸拉链、谷氨酸激酶结构域、NAD(P)H结合位点、亮氨酸结构域、谷氨酸半醛脱氢酶结构域，故西瓜P5CS酶可能也是双功能酶。西瓜的2个P5CS基因核酸序列及其氨基酸序列的相似性分别为74.19%和77.12%，除亮氨酸结构域差别较大外，其他保守结构域基本一致，由于亮氨酸结构域具有维持蛋白四级结构的功能，故推测Cla006553和Cla017928基因的空间结构可能有较大差异。

为了了解Cla006553和Cla017928基因的抗旱抗盐胁迫功能，本研究采用35S启动子驱动这2个基因，通过卡那霉素筛选及PCR验证，得到这2基因过表达拟南芥转基因后代，并取Cla006553-1、Cla006553-3、Cla017928-1和Cla017928-2株系进行后续试验。发芽试验及苗期渗透胁迫试验结果表明，Cla006553和Cla017928均能显著提高转基因植株的发芽率，缓解渗透胁迫对根生长的抑制作用。在正常生长的Cla006553和Cla017928转基因拟南芥株系中，其脯氨酸含量显著高于野生型及对照23A-1，说明转ClP5CS植株能引起脯氨酸的积累。在转ClP5CS基因拟南芥株系中，Cla017928-1株系脯氨酸含量显著高于Cla006553-1及Cla006553-3，而Cla006553-3株系含量显著高于Cla006553-1，同样的现象也发生在转AtP5CS和OsP5CS的矮牵牛花株系上[9]，这可能与ClP5CS蛋白的空间结构及其基因在拟南芥染色体上的位置和拷贝数不同有关。转基因和野生型拟南芥经300 mmol/L NaCl和干旱处理7 d后，脯氨酸含量均保持较高水平，其中转ClP5CS基因植株叶片中脯氨酸含量略高，但差异不显著。在脯氨酸积累过程中，由于P5CS的反馈抑制作用，导致P5CS酶活性降低，这可能是后期脯氨酸含量差异不大的原因。转ClP5CS基因植株的耐盐耐旱性较强的原因可能是由于其脯氨酸基础含量高，在胁迫前期就能对细胞就起到保护作用，故幼苗根的生长及苗的成活率教好。Zhang等[18]将豇豆VaP5CS酶的129位苯丙氨酸突变为丙氨酸(VaP5CSF129A)后，其在大肠杆菌中的活性是野生型的200多倍。转VaP5CSF129A的烟草植株可耐200 mmol/L NaCl胁迫，其脯氨酸含量是对照的11～19倍[19]。同样，转VaP5CSF129A的蒙农杂种冰草植株用质量分数1.5% 的NaCl溶液胁迫后，植株中的脯氨酸含量逐渐增加，14 d后转基因株系的脯氨酸含量超过2 000 μg/g[20]。但过量的脯氨酸对植物生长有负面的影响，如外源施用过量的脯氨酸(40～50 mmol/L)能抑制水稻的生长[21]。另外，将拟南芥中编码PDH(脯氨酸降解反应第一步所涉及的酶)的基因插入突变后，突变植株对脯氨酸非常敏感，在含10 mmol/L脯氨酸的培养基上不能生长，而野生型植株却能正常生长[22]。