段梦颖，刘 坤，尚红梅，杨君研，李 然，吴洪新

(1吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2 中国农业科学院 草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010)

聚合草(SymphytumofficinaleL.)又名爱国草、友谊草、紫根草、紫草，是紫草科聚合草属多年生草本植物，其适应性广、富含蛋白质和各种维生素、纤维素含量低、利用期长，是一种优良的高产饲料作物[1]。聚合草具有抗炎、止痛、抗渗出等药效[2]，主要用于治疗创伤、褥疮、扭伤和骨折等[3]，这些药理作用与其含有的一些重要化学成分(尿囊素、迷迭香酸和多糖)有关[4]。多糖是由单糖分子聚合而成的一类高分子化合物，广泛分布于动物、植物和微生物中。大量研究发现，多糖具有免疫调节[5]、降血糖[6]、降血脂[7]、抗肿瘤[8-9]、抗病毒[10]、抗氧化[11]等生物学活性，而且对正常细胞无毒副作用，因此越来越受到研究人员的重视。脱水干燥是多糖加工的重要工艺，干燥方式对多糖的理化性质和生物活性有显著影响[12]。目前，多糖的干燥方式主要包括热风干燥、真空干燥和冷冻干燥。热风干燥由于具有操作简便和成本低的特点，而被广泛应用于食品加工业。然而，在热风干燥过程中，多糖的理化性质可能会发生变化，进而影响多糖的生物活性[13]。真空干燥可防止多糖在干燥过程中的氧化反应，但是真空干燥过程中的较高温度可能会导致多糖的结构受到破坏[14]。冷冻干燥过程中的真空和冷冻环境可以最大限度地保护多糖的生物活性[15]，然而冷冻干燥需要的时间较长，能耗较高。因此，干燥方式的选择对于多糖理化性质和生物活性的保持具有重要意义。目前，国内外尚未见关于聚合草多糖干燥方式的报道，本试验探讨了不同干燥方式(热风干燥、真空干燥和冷冻干燥)对聚合草多糖理化性质和抗氧化活性的影响，以期找到一种较有利于保持聚合草多糖抗氧化活性的干燥方法，为聚合草的加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2016年于吉林农业大学刈割开花期聚合草，留茬5 cm。将聚合草切成5 cm小段，在50 ℃下烘干，粉碎后过0.45 mm筛，得聚合草粉末，装入自封袋，放入-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2 主要仪器和药品规格

HX-J型旋涡混合器，常州朗越仪器制造有限公司；752型紫外可见分光光度计，上海现科分光仪器有限公司；101-2-BS型电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司；XMTD-204型数显式电热恒温水浴锅，上海跃进医疗器械有限公司；SCIENTZ-12N型真空冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；2XZ-2型旋片式真空泵，临海市谭氏真空设备有限公司；JJ-5型控温电动搅拌器，金坛市医疗仪器厂；DZF型真空干燥箱，上海龙跃仪器设备有限公司；NDJ-8S型黏度计，上海绩泰电子科技有限公司。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，东京化成工业株式会社；2,2′-联氨-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(2,2′-azino-bis(3-ehtylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt radical，ABTS)，Blotopped公司。其他化学试剂均为国产分析纯级试剂。

1.3 试验方法

1.3.1 聚合草多糖的提取 用体积分数95%乙醇预处理(40 ℃)聚合草粉末24 h，以除去单糖、色素和脂类等分子，抽滤、干燥后得到多糖提取原料。称取25 g预处理后的聚合草粉末，加入500 mL去离子水提取聚合草多糖，提取温度90 ℃，提取时间3 h。将提取液用6层纱布过滤，收集滤液离心(3 000 r/min，10 min)，取上清液，60 ℃条件下减压浓缩至原体积的1/4，加入3倍体积无水乙醇醇沉12 h，离心(3 000 r/min，10 min)，将沉淀用去离子水溶解，用Sevag试剂(V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1)除蛋白，透析(MWCO 1400 Da，联合碳化)得聚合草多糖。试验重复4次。

1.3.2 聚合草多糖的干燥 将聚合草多糖溶液平铺于玻璃培养皿中，厚度2 mm，采用3种不同方式(热风干燥、冷冻干燥、真空干燥)进行干燥。热风干燥在电热鼓风干燥箱(50 ℃)中进行；冷冻干燥在真空冷冻干燥机内进行，冷冻温度为-66 ℃，真空度为0.19 Pa；真空干燥在真空干燥箱(50 ℃，0.09 MPa)中进行。重复4次。干燥后计算聚合草多糖得率：

。

1.3.3 多糖化学组成的测定 总糖含量采用苯酚硫酸法[16]测定，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G250染色法[17]测定，氨基糖含量采用Elson-Morgan法[18]测定，糖醛酸含量采用硫酸-间羟联苯法[19]测定，硫酸基含量采用氯化钡-明胶比浊法[20]测定，水分含量采用恒重法[21]测定。各组分含量以其占干质量的百分比计算。试验重复3次。

1.3.4 pH和相对黏度的测定 配制2 mg/mL的聚合草多糖水溶液，在25 ℃条件下用pH计读取5 min内的稳定数值[15]。配制10 mg/mL的聚合草多糖水溶液，在25 ℃条件下测定黏度，同时测定去离子水黏度，计算相对黏度[22]。试验重复3次。

1.3.5 不同干燥方式处理后聚合草多糖溶解时间的测定 称取聚合草多糖0.1 g置于150 mL烧杯中，加入50 mL蒸馏水，然后在不同水浴温度(20，40，60，80和100 ℃)下溶解，用磁力搅拌器搅拌(150 r/min)，记录溶解所需时间[12]。试验重复3次。

1.3.6 不同干燥方式对聚合草多糖抗氧化活性的影响 1) DPPH·自由基清除活性。向DPPH·溶液(1 mL 0.1 mmol/L的无水乙醇溶液，现用现配)分别加入3 mL不同质量浓度(0.01，0.025，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40 mg/mL)的聚合草多糖溶液，混匀,室温下在暗处反应30 min。用无水乙醇作空白调0，在517 nm下测定吸光度(D517 nm)，以抗坏血酸(VC)作阳性对照[11]。试验重复3次。DPPH·自由基清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%,其中A0为用蒸馏水代替多糖样品测定的D517 nm值；A1为多糖样品的D517 nm值；A2为用无水乙醇代替DPPH·溶液测定的D517 nm值。

2)ABTS·自由基清除活性。ABTS·溶液的配制：将5 mL ABTS溶液(7 mmol/L)和1 mL过硫酸钾溶液(15 mmol/L)混合，在室温、避光条件下反应12 h，得到ABTS·储备液，使用时用蒸馏水稀释成工作液，使其于室温下在734 nm处的吸光度(D734 nm)为0.70±0.02。

取ABTS·工作液3 mL与0.75 mL不同质量浓度(0.05，0.10，0.25，0.50，1.00，1.50 mg/mL)的多糖溶液混合，室温反应15 min，用蒸馏水作空白调0[23]，测D734 nm的值。以VC作阳性对照，重复3次。ABTS·自由基清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%,其中A0为用蒸馏水代替多糖样品测定的D734 nm值；A1为多糖样品测定的D734 nm值；A2为用蒸馏水代替ABTS·溶液测定的D734 nm值。

3)还原力测定。取不同质量浓度(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL)的多糖溶液1.5 mL，分别加入1.5 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.6)和1.5 mL铁氰化钾溶液(10 g/L)，混合物在50 ℃条件下水浴20 min，冷却后加入1.5 mL三氯乙酸溶液(100 g/L)混合，然后取该混合物1.5 mL，加入1.5 mL去离子水和0.3 mL氯化铁(1 g/L)溶液，室温下反应10 min后，在700 nm处测定吸光度(D700 nm)，以蒸馏水为空白调0[24]。以VC作阳性对照，重复3次。还原力=A1-A2，其中A1为多糖样品测定的D700 nm值；A2为用蒸馏水代替氯化铁溶液测定的D700 nm值。

1.4 数据统计与分析

数据以“平均值±标准误”表示，采用SPSS 22.0统计软件进行数据方差分析，用Duncan’s法进行多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 干燥方式对聚合草多糖得率及理化性质的影响

由表1可知，冷冻干燥的聚合草多糖得率(12.44%)显著高于热风干燥(8.07%)和真空干燥(9.37%)多糖(P<0.05)。多糖的生物活性受其化学组成的影响[22]，由本试验测定结果(表1)可知，不同干燥方式对聚合草多糖氨基糖和水分含量无显著影响(P>0.05)；冷冻干燥多糖的总糖含量显著高于热风干燥和真空干燥(P<0.05)；冷冻干燥和真空干燥多糖的蛋白质、糖醛酸和硫酸基含量差异不显著，但均显著高于热风干燥多糖(P<0.05)。不同干燥方式对聚合草多糖pH无显著影响(P>0.05)；冷冻干燥和真空干燥多糖的相对黏度无显著差异(P>0.05)，但均显著高于热风干燥多糖(P<0.05)。由以上分析可知，冷冻干燥是获得较高多糖得率和保存聚合草多糖中活性成分(如总糖、蛋白质、糖醛酸和硫酸基含量)较为有效的手段，其次是真空干燥，热风干燥最差。

表1 干燥方式对聚合草多糖化学组成、pH和相对黏度的影响Table 1 Effects of drying methods on chemical composition,pH and relative viscosity of polysaccharides from comfrey

注：同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).The same below.

由表2可知，聚合草多糖的溶解时间随着温度的升高而逐渐缩短，且不同干燥方式对聚合草多糖的溶解时间有显著影响(P<0.05)。在20～100 ℃下，冷冻干燥多糖的溶解时间显著短于热风干燥和真空干燥多糖(P<0.05)，这可能是因为冷冻干燥多糖结构疏松，相对更容易溶解；热风干燥和真空干燥多糖的溶解时间差异不显著(P>0.05)。

表2 干燥方式对聚合草多糖溶解时间的影响Table 2 Effects of drying methods on dissolution time of polysaccharides from comfrey min

2.2 干燥方式对聚合草多糖抗氧化活性的影响

2.2.1 DPPH·自由基清除活性 由于试验操作的简便性和稳定性，DPPH·自由基清除活性被广泛应用于测定样品的抗氧化能力[11]。干燥方式对聚合草多糖DPPH·自由基清除活性的影响如图1所示。由图1可知，冷冻干燥多糖的DPPH·自由基清除活性最高，且显著高于热风干燥多糖(P<0.05)。在多糖质量浓度为0.01～0.2 mg/mL时，3种干燥方式所得聚合草多糖的DPPH·自由基清除率均显著低于VC(P<0.05)；当多糖质量浓度达到0.3，0.4 mg/mL时，冷冻干燥聚合草多糖的DPPH·自由基清除率分别达到56.89%和57.09%，与相应质量浓度VC的DPPH·自由基清除率(0.3 mg/mL时为58.23%,0.4 mg/mL时为58.52%)无显著差异(P>0.05)。据报道，在多糖质量浓度为1.0 mg/mL时，桦褐孔菌多糖的DPPH·自由基清除率大约为40%[25]，灵芝多糖的DPPH·自由基清除率为20%～40%[13]，与之相比聚合草多糖的DPPH·自由基清除活性较强，且冷冻干燥所获聚合草多糖的DPPH·自由基清除活性最高。

图1 干燥方式对聚合草多糖DPPH·自由基清除活性的影响Fig.1 Effects of drying methods on DPPH· radical scavenging activity of polysaccharides from comfrey

2.2.2 ABTS·自由基清除活性 ABTS·自由基清除活性的测定方法操作简单快速，被广泛应用于样品的抗氧化活性评估[23]。该方法是基于抗氧化剂可提供电子或氢原子灭活自由基，导致ABTS·溶液颜色发生变化，再通过分光光度计进行测定的一种方法。由图2可知，当多糖质量浓度为0.1～0.5 mg/mL时，冷冻干燥聚合草多糖的ABTS·自由基清除率显著高于热风干燥和真空干燥多糖(P<0.05)，且热风干燥多糖的ABTS·自由基清除率最低。据报道，羟基在多糖发挥ABTS·自由基清除活性中起重要作用[15]。但是，在有氧条件下，羟基很容易发生氧化反应，热风干燥过程中多糖暴露在有氧条件下，因此热风干燥多糖的ABTS·自由基清除活性较低。当多糖质量浓度达到1.0 mg/mL后，3种干燥方式所得多糖的ABTS·自由基清除活性达到VC水平；在多糖质量浓度为1.5 mg/mL时，聚合草多糖的ABTS·自由基清除活性达到最大，此时冷冻干燥多糖对ABTS·的清除率达99.70%。据报道，亚侧耳冷冻干燥多糖(4 mg/mL)的ABTS·自由基清除率大约为30%[15]，芜菁多糖(2 mg/mL)的ABTS·自由基清除率大约为23%[26]，与之相比聚合草多糖具有较强的ABTS·自由基清除活性。

2.2.3 还原力 还原力是评价天然产物抗氧化能力的重要指标[24]。由图3可知，在多糖质量浓度为0.2～1.0 mg/mL时，冷冻干燥多糖的还原力显著高于热风干燥多糖和真空干燥多糖(P<0.05)，但3种干燥方式多糖的还原力均显著低于VC(P<0.05)。据报道，在质量浓度为10 mg/mL时，大蒜[27]和亚侧耳[15]多糖的还原力均约为0.5，本试验在质量浓度为1.0 mg/mL时，冷冻干燥聚合草多糖的还原力达到0.83，说明聚合草多糖具有较强的还原力。

图2 干燥方式对聚合草多糖ABTS·自由基清除活性的影响Fig.2 Effects of drying methods on ABTS· radical scavenging activity of polysaccharides from comfrey

3 讨论与结论

3.1 干燥方式对聚合草多糖理化性质的影响

冷冻干燥技术的特点为低温脱水，使物料本身的物理、化学和生物状态基本不变，从而使物料本身的营养物质和有效成分得到最大保留。热风干燥和真空干燥技术都是通过高温加热来达到干燥的目的，虽然都具有干燥速度快、效率高等特点，但是在干燥过程中对具有挥发性和热敏性成分的物料具有较大的破坏作用[28]。张雨婷等[28]研究了不同干燥方法对铁皮石斛中有效活性成分铁皮石斛多糖和甘露糖含量的影响，结果表明真空冷冻干燥法能最大程度地保留样品中的多糖和甘露糖。邱梦鸽等[29]研究了干燥方法对白背毛木耳多糖抗氧化活性的影响，结果表明冷冻干燥多糖的抗氧化活性最强，是制备白背毛木耳多糖适宜的干燥方法。

本试验结果表明，冷冻干燥聚合草多糖的总糖含量显著高于热风干燥和真空干燥(P<0.05)，冷冻干燥多糖的蛋白质、糖醛酸和硫酸基含量显著高于热风干燥多糖(P<0.05)。可能原因是热风干燥过程中较高温度(50 ℃)及有氧条件导致聚合草多糖某些化学成分变性，而冷冻干燥的低温和真空条件使微生物的生长和酶的作用受到抑制，利于多糖活性成分的保存。因此，冷冻干燥法是保存聚合草多糖中活性成分(如总糖、蛋白质、糖醛酸和硫酸基含量)较有效的手段。

3.2 干燥方式对聚合草多糖抗氧化活性的影响

冷冻干燥多糖的抗氧化活性(DPPH·、ABTS·自由基清除活性和还原力)显著高于热风干燥和真空干燥多糖(P<0.05)，可能原因是不同干燥方式导致多糖有效成分(总糖、蛋白质、糖醛酸和硫酸基等)含量有差异。据报道，多糖的糖醛酸含量与其自由基清除活性呈显著正相关[30]，而本试验研究发现，冷冻干燥多糖的糖醛酸含量高于热风干燥和真空干燥多糖，因此，冷冻干燥多糖的抗氧化活性较高。

本试验研究还发现，聚合草多糖具有较强的DPPH·、ABTS·自由基清除活性和还原力。实际上，多糖发挥抗氧化作用的机制有多种。首先,多糖可能含有一些其他的抗氧化成分，比如肽类、黄酮、色素、多酚和蛋白质，这些成分可能对多糖的抗氧化活性有作用[31]。其次多糖的金属螯合能力与其抗氧化活性有关，而多糖分子结构中的硫酸基和糖醛酸是多糖发挥金属螯合作用的基本基团[32]。聚合草冷冻干燥多糖的蛋白质、糖醛酸和硫酸基含量分别为5.77%，8.51%和1.12%，这些化学成分可能对聚合草多糖的抗氧化活性起到一定的作用。

综上所述，不同干燥方式(热风干燥、冷冻干燥、真空干燥)对聚合草多糖化学组成(总糖、蛋白质、糖醛酸和硫酸基含量)、相对黏度和溶解时间等理化性质及抗氧化活性有显著影响(P<0.05)。与热风干燥和真空干燥多糖相比，冷冻干燥多糖具有更强的还原力及DPPH·和ABTS·自由基清除活性(P<0.05)。因此，冷冻干燥法是制备聚合草多糖较好的干燥方式。