郝景昊，李中贤，何金环，王 强,

(1 河南牧业经济学院 基础部，河南 郑州 450046；2 河南省科学院 高新技术研究中心，河南 郑州 450002)

食用植物油是日常膳食的重要组成部分，直接影响到食物的口感和营养。众所周知，食用油由甘油三酯分子组成，影响人体健康的主要是脂肪酸种类，富含不饱和脂肪酸如油酸(ω-9)[1]和亚麻酸(ω-3)[2]的油脂有利于人体健康。

我国是世界上最大的食用植物油生产、消费和进口国，随着人口增长和人们生活水平的提高，植物油市场也变得日益多样化、细分化和高档化。目前市场上流通的食用油有大豆油、花生油、菜籽油、葵花籽油、芝麻油、玉米油、橄榄油等。植物油的价格与其类型和营养价值有关，不同来源的食用油价格相差巨大，因此一些不法商家为了追求暴利，以相对廉价的植物油冒充或者勾兑高端植物油。植物油的掺伪不仅扰乱市场秩序、侵犯消费者权益，更严重的甚至危害消费者的身体健康。因此，食用植物油的品质检测,对餐饮和食品工业中食用油的选择以及食物的质量控制尤为重要。

传统食用油脂肪酸组成的检测方法是气相色谱法，这是由美国油脂化学会制定的用于检测脂肪酸含量的美国分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists，AOAC)的官方方法[3]，但该方法费力、耗时且耗费试剂，涉及到甘油三酯的水解、游离脂肪酸与甲醇的酯化或直接进行的酯交换反应等过程，然后需要分离、鉴定后再用GC来定量[4]。另外，还存在衍生化过程中样品的氧化、甲酯后续的分离和鉴定等问题[5-6]以及脂肪酸标准品的购置等，因此急需寻找更简便、准确、快捷、经济的检测方法。

食用植物油中甘油三酯的脂肪酸种类和含量因来源植物的不同而变化，每一种植物油因其物种不同而有其特征组成，即可以通过脂肪酸种类和含量的不同来鉴别食用植物油的真伪。核磁共振(Nuclear magnetic resonance，NMR)通常用于化学结构、构型和纯度的检测，近年来，核磁共振结合化学计量学已经快速进入混合物分析和质量控制领域[7-14]。相较于其他光谱技术，核磁共振具有很多优点，尤其是在NMR谱中可以获得大量的信息。例如，对未进行任何前处理的研究样品直接进行采样获得的NMR图谱会随样品的变化而变化，故可通过每一个化合物的NMR特征信号对复杂混合物的每一个成分进行鉴别和定量。利用这种特征，每一个脂肪酸，主要是不饱和脂肪酸，由于其1H和13C NMR谱特征信号都不同，因此用其来进行分析和检测是可行的[15-18]。

由于13C核的天然丰度很低，而且定量碳谱每次采样之间的延迟时间需要设置得较长，以使碳原子能够充分弛豫，这就导致检测时间大大延长。而1H NMR谱检测的氢原子具有很高的天然丰度，使得氢谱只需要几次采集即可得到信噪比很高的图谱。因此，通常选用1H NMR谱作为检测脂肪酸组成的工具。应用NMR对食品或油脂进行检测的常用方法是采集核磁共振氢谱后，对图谱各峰进行积分或分段积分，或者通过计算得到一些数据，然后再用PCA、PLS、HLA等聚类分析方法来进行分类和判断[19-25]。但该方法也存在一定的不足，比如分段积分的主要弊端在于不同磁场强度的仪器得到的数据不能通用，计算得到的数据不直观；另外聚类分析方法比较复杂，而且分析软件的价格比较昂贵(如SIMCA-P、SPSS、Unscrambler等)，普及率不高。为此，本研究拟基于食用油的1H NMR谱，通过对各峰积分值进行制图比较，探索一种方便、快速、有效鉴别掺伪食用油及食用油种类的方法，以期为掺伪食用油的有效快速判定提供支持。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂及样品制备

供试花生油(10份)、大豆油(10份)、芝麻油(10份)、葵花籽油(7份)、玉米油(6份)均购自国内超市，品牌包括福临门、金龙鱼、鲁花、春芝、李耳、一滴香、爱厨等。棕榈油(7份)、棉籽油(7份)、菜籽油(6份)来自国内食用油生产厂商。氘代氯仿(CDCl3)购自CIL(Cambridge Isotope Laboratories)，氘代度99.8%，含0.03% TMS。取50 μL油脂样品置于5 mm样品管中，加入0.6 mL CDCl3，涡旋振荡摇匀备用。

1.2 仪器型号和试验参数

仪器型号：BRUKER Avance 300和Agilent 400 MR核磁共振波谱仪。1H NMR谱测定参数为：温度295 K，谱宽8 000 Hz，脉冲间隔2 s，扫描次数16次，以四甲基硅烷(TMS，氢的化学位移δH=0.00)为内标。

1.3 图谱采集和数据处理

制备各类油脂的CDCl3溶液，分别在300和400 MHz仪器上采集1H NMR谱，将采集到的FID信号用Mestrenova 10.0.1(Mestrelab Research S.L.，Spain)进行傅里叶变换处理，然后进行相位校正和基线校正，并以TMS信号峰进行位移校正后，根据积分区间自低场到高场分别对峰A(δH=5.75～4.94)、峰B(δH=4.39～3.99)、峰C(δH=2.88～2.66)、峰D(δH=2.41～2.21)、峰E(δH=2.15～1.91)、峰F(δH=1.73～1.50)、峰G(δH=1.44～1.16)、峰H(δH=1.01～0.96)及峰I(δH=0.96～0.77) 9个峰进行手动积分(图1)，将峰B(δH=4.39～3.99)的积分面积定为1(甘油的2个亚甲基峰)，从而可以得到其他各组峰的相对积分面积。

2 结果与分析

因大豆油核磁共振氢谱中的信号峰能够展示所有油脂中的峰，因此可用大豆油的核磁共振氢谱来标注食用油中各种质子的位移，结果如图1所示。由图1可以看出，δH=1.01～0.94(峰H) 的峰为亚麻酸(ω-3)的甲基信号，并非所有的食用油都有这组信号[3]。根据食用油有无亚麻酸的甲基信号峰可将食用油分为2组，其中1组为含有亚麻酸的油脂，常见的为大豆油和菜籽油；另1组为不包含亚麻酸的油脂。选取已知的食用油核磁共振氢谱中7组峰(不包括峰B，因其作为积分基准面积均设为1)的任意2组(如AC、AD、BD等)或3组峰(如ACD、ACE、BDE等)的积分面积输入origin6.1(OriginLab Corporation,USA)软件，本研究选择AC 2组及ACE 3组，然后以不同积分面积值分别作为横坐标(X)、纵坐标(Y)或轴向坐标(Z)制作二维或者三维图，得到已知正品油脂的标准图谱库，然后将未知样品按照上述操作所得到的对应峰的积分值代入上述二维图、三维图进行比对鉴定。

图1 大豆油1H NMR谱各信号峰的归属Fig.1 1H NMR assignment of soybean oils

2.1 各类油脂的判别

在低场核磁共振(300～400 MHz)中，脂肪酸双键质子和甘油次甲基质子(1和2)的信号往往不能完全分开，为适应各种不同磁场强度的仪器，将这2组质子合并作为峰A来进行积分。大豆油和菜籽油分别以峰A和峰C的积分面积作为横坐标和纵坐标，得到二维图如图2所示。从图2可以看出，大豆油和菜籽油利用峰A和峰C的积分面积能够完全分开并各自聚类。

另外，对花生油、芝麻油、棕榈油、玉米油、棉籽油和葵花籽油这些不包含亚麻酸(峰H)的油脂，以峰A和峰C的积分面积分别为横坐标和纵坐标，得到二维图如图3所示。从图3可以看出，通过制作二维图,这几种不包含亚麻酸的油脂也能够完美分离并各自聚类。图2和图3表明，选取食用油1H NMR谱中各信号峰积分面积中的2个制作二维图，即能够对食用油脂的种类进行准确判别，并且对各种磁场强度的仪器测试得到的核磁共振氢谱中各组峰的积分数据均可使用，且不影响结果的判定。

2.2 掺伪油脂的判别

不法商贩为了获得更高的经济利益，通常会在价值高的食用油中掺入价值较低的食用油。为了实现掺伪食用油的辨别，本研究配置了一些掺伪油脂进行分析判断。常见食用油脂中芝麻油价格相对较高，故本研究配置的掺伪油脂以芝麻油为基础，掺入其他相对廉价的食用油。

图2 大豆油和菜籽油的二维图Fig.2 2D diagram of soybean oils and rapeseed oils

图3 花生油、芝麻油、棕榈油、玉米油、棉籽油和葵花籽油的二维图Fig.3 2D diagram of peanut oils,sesame oils,palm oils, corn oils,cottonseed oils and sunflower oils

本研究在芝麻油中分别掺入的廉价油脂为葵花籽油和花生油，两者的掺入量均为24，48，91，130和167 mL/L，分别制得5份掺有葵花籽油和花生油的掺伪芝麻油油脂。未选择价格更低的大豆油作为掺伪食用油，是因为掺入24 mL/L的大豆油便能在图谱中发现δH=1.01～0.94(峰H)的亚麻酸峰，即可判别不是芝麻油。

将按照前述样品制备方法(1.1节)得到的5份掺伪芝麻油样品于BRUKER Avance 300核磁共振波谱仪上测定氢谱，并进行图谱采集和数据处理等，得到的积分数据(峰A和C)代入包含纯芝麻油的标准图谱(图3)中，结果如图4所示。

图4 花生油、芝麻油、葵花籽油及掺葵花籽油或花生油的2种芝麻油的二维图Fig.4 2D diagram of peanut oils,sesame oils,sunflower oils,sunflower oils and peanut oils adulterated sesame oils

从图4可以清晰看出，掺伪芝麻油与纯芝麻油在图中混在一起，不能准确判别，因此增加另一个判别因子，即峰E的积分面积作为Z坐标制作三维图，结果见图5。

图5 花生油、芝麻油、葵花籽油及掺葵花籽油或花生油的2种芝麻油的三维图Fig.5 3D diagram of peanut oils,sesame oils,sunflower oils,sunflower oils and peanut oils adulterated sesame oils

从图5可以看出，掺葵花籽油和掺花生油的芝麻油，与纯正芝麻油能够完全分开，说明掺伪芝麻油能够被准确辨认，表明利用3个变量(本研究中为峰A、C和E的积分值，采用其他任意3组积分值均可)就能够对掺伪油脂进行有效判别。需要说明的是，虽然该方法可以区分油脂是否掺伪，但同一种掺伪油脂在不同掺伪量之间并无明显区别，若需知道掺伪量，还需采用其他方法进一步测定。但从本研究来看，最低掺伪量(24 mL/L)很小，该掺伪量已无法给不法商贩带来经济利益，故可作为本检测方法的最低检测限。

2.3 掺假食用油1H NMR判别的影响因素分析

值得注意的是，食用油1H NMR图谱的处理情况(相位校正、基线校正、积分区间等)能够影响食用油的判别结果。化学位移、相位和基线的校正是影响判别结果的一个方面，其中化学位移和相位很容易准确校正，但需要注意的是，由于基线校正的方法较多(如多项式拟合、Whittaker、Splines等)，所有图谱均要使用同一种基线校正方法，否则得到的积分数值差异很大。此外，仪器的90°脉宽要测量准确，采样程序中脉冲的激发角度和脉冲间隔要设置一致。测试中发现，甘油三酯的纵向弛豫时间(T1)一般为5～6 s，因此要使甘油三酯分子充分弛豫，脉冲间隔应在25～30 s，但这样设置会导致采样时间太长。为了节约试验时间，可以不用5×T1的脉冲间隔，但不同仪器不同样品的脉冲间隔一定要保持一致，以便得到正确的判别结果。为了显示不同的脉冲间隔对积分值及判断结果的影响，选取大豆油在Agilent 400 MR仪器上进行测定，将分别用1，2和25 s的脉冲间隔得到的积分面积分别用大豆油1、大豆油2和大豆油25表示，并与同样条件下得到的脉冲间隔2 s的菜籽油的积分面积，采用origin 6.1制作二维图如图6所示。

图6 菜籽油和大豆油不同脉冲延迟时间的二维图Fig.6 2D diagram of rapeseed oils and soybean oils with different relaxation delay times

从图6可以看出，随着脉冲间隔的延长(1～25 s)，峰A的面积也随之增大，而峰C增大的趋势不明显。这是因为峰A主要包含的是不饱和的双键碳上的质子，弛豫时间较长，所以脉冲间隔的变化对其影响较大；而峰C是连接在2个不饱和双键之间饱和亚甲基碳上的质子，弛豫时间相对较短，所以脉冲间隔的改变对其影响不大。

3 结 论

通过各种食用油测试得到1H NMR图谱，对其各个信号峰进行积分并利用其中2组积分面积制作二维图，能够对各种食用油进行准确分类；同时利用3组积分值，可以对掺伪食用油进行准确判别，最低掺伪量为24 mL/L，表明该方法是一种快速、准确、经济的食用油掺伪鉴别方法，可以作为现行食用油检测判定方法的补充。如何通过食用油1H NMR图谱中各峰的积分值，来对调和油中各组分的种类和比例进行判定，将是下一步研究的重点内容。