蒋书东，张兴旺，朱 晖，周伟娟，王登峰，方富贵

(安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036)

神经激肽B(Neurokinin B，NKB)是速激肽家族成员之一，主要分布于中枢神经系统及其周围组织中，编码NKB的基因在啮齿动物为Tac2，在人和犬为Tac3。NKB通过其受体NK3R发挥活性作用，而NK3R在中枢神经系统及其周围组织中都有很广泛的分布。NKB生物学作用广泛，包括松弛血管、减慢心率、降低平均动脉压、诱发炎症反应、促进细胞因子及炎症介质的释放、收缩瞳孔括约肌缩小瞳孔、脊髓水平的抗伤害性感受作用及调节有关运动等众多生物学作用[1-5]。随着人们对NKB研究的不断深入，国内外众多学者注意到其在生殖调控中也扮演着重要角色，并引起了极大关注。

NKB最早是从猪脊髓中分离得到的[4,6]。前人研究发现，NKB分布于出生后大鼠的下丘脑、黑质、纹区、大脑皮层和脊髓，且含量在出生后第2周升高，于出生后15 d左右超过成年水平，随后逐渐下降至成年水平[7-8]。李东培等[9]发现，NKB在大鼠基底前脑高度表达。Krajewski等[10]提出，NKB神经元主要分布于大鼠下丘脑的弓状核，少数散布于下丘脑前侧、背内侧、视前区以及终纹床核和杏仁核。目前，NKB在生殖轴上的分布研究主要集中在大鼠[11]、绵羊[12]、猴[13]等动物上，而关于其在犬生殖轴上的表达研究尚未见报道。为此，本试验采用免疫组化方法，观察了NKB在成年犬生殖轴上的分布，并采用RT-qPCR方法检测Tac3 mRNA表达量在不同发育阶段母犬生殖轴中的变化，旨在探明NKB在犬生殖轴上的表达规律。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物 试验动物为市售健康中华田园犬，其中成年期(24月龄)公((9.2±0.74) kg/只)、母((8.3±0.50) kg/只)犬各3只，用于免疫组化试验；仔犬期(1月龄，(1.0±0.22) kg/只)、幼犬期(4月龄，(2.6±0.29) kg/只)、初情期(6～7月龄阴门红肿初次发情的犬只，(6.8±0.34) kg/只)和成年期(24月龄，(8.5±0.35) kg/只)母犬各3只，用于RT-qPCR。试犬在安徽农业大学动物饲养房笼养，供给充足的全价日粮和水，以保证试验犬健康。

1.1.2 主要仪器及试剂 荧光定量PCR仪(FTC2000)，购自上海枫岭生物技术有限公司。

DAB显色试剂盒(ZLI-9018)和多聚赖氨酸(ZLI-9005)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；多聚甲醛(T20080904)，购自国药集团化学试剂有限公司；NKB一抗(SC-14109，羊抗鼠IgG，稀释倍数1∶50)和免疫组化试剂盒(SC-3945，二抗兔抗山羊IgG-R，稀释倍数1∶100)，购自美国Santa Cruz公司；焦碳酸二乙酯(DEPC，V900882)，购自美国Sigma公司；RT试剂盒(PCR-311)、荧光定量PCR试剂盒(05015278001)和Sybr Green Ⅰ染料(ZS00201)，均购自中国上海Shinegene公司。

1.2 试验方法

1.2.1 NKB在犬生殖轴上分布的检测 采用免疫组化法。颈动脉放血处死试验犬，剖取下丘脑、垂体、睾丸和卵巢，公犬同时采集胃作对照组织，40 g/L多聚甲醛处理后进行NKB免疫组化试验，主要流程为：样本采集→40 g/L多聚甲醛固定→流水冲洗→梯度酒精脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→烘片→二甲苯脱蜡→梯度酒精脱水→柠檬酸钠抗原修复→过氧化氢孵育，阻断内源性过氧化物酶的活性→非免疫动物血清孵育→滴加一抗→冲洗、滴加二抗→DAB显色→梯度酒精脱水→二甲苯脱蜡→封片→观察NKB分布情况并拍照。阴性对照组将一抗换成等量PBS。

1.2.2Tac3 mRNA在犬生殖轴上表达量的检测 颈动脉放血处死试验犬,剖取下丘脑、垂体和卵巢，立即放入装有1 mL TRIzol的冻存管中并投入液氮冻存，-80 ℃冰箱保存，按如下流程提取RNA：取30 mg组织制备组织匀浆→静置5 min→加入200 μL氯仿，剧烈振荡→于冰盒上静置10 min后4 ℃下12 000g离心15 min→取上层无色水相，与等体积异丙醇混匀→静置后4 ℃条件下10 000×g离心1 min，弃去滤液→RNA Wash Buffer Ⅰ清洗，弃滤液→RNA Wash Buffer Ⅱ清洗(2次)，弃滤液→DEPC Water 30 μL洗脱RNA，-80 ℃保存。将RNA反转录为cDNA，反转录体系如下：2×RT buffer 10 μL，6N随机引物(100 pmol/μL) 1 μL，RT-mix 1 μL，模板(RNA) 5 μL，DEPC水3 μL。

以GAPDH为内参基因，通过RT-qPCR试验测定样本中的Tac3 mRNA表达量。试验所用引物的设计和合成均由上海Shinegene分子生物科技有限公司完成。引物信息为：Tac3，F：5′-TTGGGGC-TGTCTGTGAGGA-3′，R：5′-CGTTTCTGGGGA-AGTGGC-3′，退火温度60 ℃，产物长度196 bp；GAPDH，F：5′-GGGGTGATGCTGGTGCTG-3′，R：5′-GCTGACAATCTTGAGGGAGTTG-3′，退火温度60 ℃，产物长度185 bp。RT-qPCR扩增体系为×PCR buffer 25 μL:上下游引物(25 pmol/μL)各1 μL，Sybr green Ⅰ 0.5 μL，模板(cDNA)2 μL，DEPC水20.5 μL。扩增条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环35次，72 ℃检测扩增产物荧光信号。采用2-ΔΔCt法[14]测算目的基因表达量。

1.3 数据分析

采用SPSS软件对数据进行检验，分析各组间差异显著性。

2 结果与分析

2.1 NKB在犬生殖轴上的分布

从免疫组织化学染色结果可知：NKB在成年母犬下丘脑、垂体、卵巢(图1)和成年公犬下丘脑、垂体和睾丸(图2)等生殖轴器官中均有表达。在成年母犬体内，NKB主要分布于下丘脑外侧区(图1-A1～A3)和视上核(图1-B1～B3)，而在弓状核(图1-C1～C3)未观察到NKB阳性细胞；在垂体,NKB阳性细胞主要分布在腺垂体前叶(图1-D1～D3)；在卵巢,NKB阳性细胞主要分布在卵巢的卵母细胞和颗粒细胞(图1-E1～E3)。

A1～A3.下丘脑外侧区，3V为第三脑室；B1～B3.下丘脑视上核；C1～C3.下丘脑弓状核；D1～D3.腺垂体；E1～E3.卵巢，E2中→标示卵母细胞，↗标示颗粒细胞；A2～E2.分别为A1～E1矩形区域的放大结果；A3、B3、D3、E3.阴性对照;C3为C2矩形区域的放大结果A1-A3.The lateral hypothalamic area,3V indicates the third ventricle；B1-B3.The nucleus supraopticus hypothalami；C1-C3.The nucleus arcuatus hypothalami；D1-D3.The adenohypophysis；E1-E3.The ovary.In E2, →indicates oocyte,↗indicates granular cells；A2-E2.Magnified version of A1-E1 box area；A3,B3,D3,E3.Negative control;C3.The magnified version of C2 box area 图1 NKB在成年母犬生殖轴上的分布Fig.1 Distribution of NKB in the reproductive axis of adult female dogs

公犬检测结果与母犬相似，NKB主要分布于下丘脑外侧区(图2-F1～F3)和视上核(图2- G1～G3)，弓状核未见阳性细胞(图2-H1～H3)；在垂体，阳性细胞分布于腺垂体(图2-I1～I2)，神经垂体未见阳性细胞分布(图2-I3)；在公犬睾丸，阳性细胞主要分布在睾丸间质细胞和生精细胞中(图2-J1～J3)。

2.2 Tac3 mRNA在母犬生殖轴上表达量变化

Tac3 mRNA在不同发育阶段母犬下丘脑、垂体和卵巢中的表达量的检测结果如图3所示。由图3可知，Tac3 mRNA表达量在不同年龄段母犬下丘脑、垂体以及卵巢中的变化趋势相似，从仔犬期到初情期Tac3 mRNA表达量均表现出升高趋势，并于初情期达到峰值，显著高于其他发育阶段，随后的成年期Tac3 mRNA表达量又显著下降；在下丘脑，成年期母犬Tac3 mRNA表达量显著低于初情期和幼犬期母犬，但显著高于仔犬期母犬；在垂体和卵巢，成年期母犬Tac3 mRNA表达量显著低于初情期母犬，但显著高于幼犬期和仔犬期母犬。

图柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)Different superscripts indicate significant difference (P<0.05)

3 讨 论

3.1 NKB在犬生殖轴上的分布

本研究的免疫组化试验结果表明，NKB在成年公、母犬下丘脑视上核和外侧区均有表达，在弓状核中不表达。Rance[15]研究指出，NKB分布于人弓状核神经元亚群；Foradori等[12]发现，绵羊的弓状核与正中隆起部位有NKB分布；Goodman等[16]在母羊的弓状核中发现了NKB神经元。本研究与前人研究结果不同的原因可能与物种的差异有关。NKB在成年公、母犬的腺垂体部均有表达，而神经垂体基本不表达，这与人们对NKB在皖西白鹅[4]、大鼠[17]以及恒河猴[13]垂体中分布的研究结果一致。宋爽等[11]利用免疫荧光染色法在大鼠腺垂体及卵巢中也检测到NKB的分布。Mijiddorj等[18]研究发现,NKB能促进垂体分泌促性腺激素释放激素(GnRH)和催乳素(Prolactin，PRL)。综合上述研究结果，笔者推测腺垂体可能是犬NKB重要的分泌或储存部位，而NKB则可能是犬垂体内分泌的一种重要的调控激素。对于生殖器官，崔培[17]发现，NKB在雌性大鼠卵巢的黄体细胞、卵泡膜、颗粒细胞和间质细胞中均有不同程度的表达。花雯等[4]发现，NKB在不同生理时期的皖西白鹅卵巢上有不同程度的表达。本试验结果表明，NKB在公犬睾丸间质细胞、生精细胞以及母犬卵巢的颗粒细胞、卵母细胞中都有表达。

3.2 Tac3 mRNA在母犬生殖轴上表达量的变化

Topaloglu等[19]研究发现，Tacr3基因(NKB受体NK3R编码基因)的核苷酸变异会在一定程度上影响女性的青春期启动。Navarro等[20]发现，随着雌鼠的成熟，其下丘脑中Tac2和Tacr3基因mRNA的表达量逐渐增大，且NKB在雌鼠初情期的启动中扮演着重要角色。

本试验结果发现，在母犬下丘脑，Tac3 mRNA从仔犬期至初情期表达量显著增加，初情期达到峰值，成年期下降。GnRH的分泌是脉冲式的，受GnRH脉冲发生器的控制[21-23]，雌性动物初情期启动的特征是GnRH分泌脉冲增加，雌二醇(E2)水平不断上升以及机体对E2负反馈效应的敏感性不断下降[23-24]，而NKB和NK3R在下丘脑弓状核神经元中都有表达，它们可能是GnRH脉冲发生器的组成部分之一[16,22,25-26]，所以NKB可能在中枢水平对母犬初情期的启动发挥调控作用，从而调控母犬的生殖活动。

花雯[4]研究发现，NKB在不同时期皖西白鹅腺垂体中均有不同程度的表达，其中以青春期和产蛋期表达量最高。本试验结果表明，Tac3 mRNA在不同发育阶段母犬垂体上的表达量也呈现出仔犬期至初情期逐渐升高，而成年期又有所下降的趋势，这与Tac3 mRNA在不同发育阶段母犬下丘脑上的变化趋势一致，提示NKB可能通过母犬垂体调控初情期启动和生殖机能，不过这还需要进一步研究。

花雯[4]还发现，就巢期和休产期皖西白鹅各级卵泡颗粒层细胞、卵泡膜及间质部位NKB表达量逐渐减少，显著低于产蛋期。在本试验中，虽然Tac3 mRNA在仔犬期和幼犬期母犬卵巢上的表达量都相对较低，但是从仔犬期至初情期，其表达量仍然呈现上升趋势，在初情期达到最高水平，至成年期表达量下降，与Tac3 mRNA在母犬下丘脑和垂体中表达量的变化趋势一致，这更加充分地说明了NKB在调控母犬初情期启动中具有重要作用。

4 结 论

NKB在成年公、母犬的下丘脑、腺垂体、卵巢和睾丸均有不同程度的表达。Tac3 mRNA在仔犬期至初情期母犬下丘脑、腺垂体和卵巢中的表达量均呈现逐渐上升趋势，于初情期达到最高水平，至成年期表达量又有所下降。该结果表明，NKB可能参与母犬初情期的启动。