玉米蔗糖非酵解型蛋白激酶2底物蛋白的筛选与鉴定

2018-10-24拓昊苑于好强李晚忱付凤玲

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2018年10期

明川，拓昊苑，陶怡，于好强，李晚忱，付凤玲

(四川农业大学玉米研究所，四川成都 611130)

脱落酸(Abscisic acid,ABA)是调节植物生长发育及应答逆境胁迫的重要激素[1-3]。近年来，在拟南芥上陆续发现的PYR/PYL/RCAR蛋白(Pyra-bactin resistance 1/PYRl-like/regulatory compon-ents of ABA receptor)、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C(Serine/threonine protein phosphatase type 2C,PP2C)和蔗糖非酵解型蛋白激酶2(Sucrose non-fermenting protein kinase 2,SnRK2)分别是ABA的直接受体和第二、第三信使[4-13]。然而，SnRK2功能呈多样化，在其接收PYR/PYL/RCAR和PP2C转导的ABA信号并通过自体磷酸化激活后，催化众多下游蛋白质的磷酸化，最终通过不同的途径调节植物对非生物逆境的抗性[12-15]。SnRK2可催化ABA响应原件结合因子(ABA responsive element (ABRE) binding factors)的磷酸化，从而调节抗逆相关基因的表达[12]。在拟南芥SnRK2.2、SnRK2.3双缺突变体中，ABRE转录因子的磷酸化水平随SnRK2活性的下降而降低，导致启动子含有ABRE元件的RD29B等抗逆相关基因的表达下调[16-18]。研究发现，SnRK2还可磷酸化激活慢阴离子通道蛋白SLAC1和钾离子通道蛋白KAT1，诱导气孔关闭[19-21]。目前，除在拟南芥上用SnRK2.2、SnRK2.3、SnRK2.6三缺突变体鉴定出少数响应ABA诱导的SnRK2底物蛋白外，对更多响应ABA诱导的SnRK2底物蛋白知之甚少[16,22]。然而，通过对已知拟南芥SnRK2底物蛋白的同源性和保守结构域分析发现，-RXXS-(RXXpS或LXRXXpS，其中S为丝氨酸，R为精氨酸，X为任意氨基酸)是SnRK2底物蛋白的保守磷酸化基序[23-25]。与拟南芥、水稻等模式植物相比，玉米基因组因大量重复和转座序列的存在而更为庞大和复杂[26-27]。在玉米中，参与ABA信号转导蛋白质家族各成员的结构和功能可能呈现多样化，而且缺少齐备的突变体，使其SnRK2(ZmSnRK2)下游底物蛋白的筛选鉴定更为困难[28]。目前，关于ZmSnRK2基因的研究仅在同源克隆、生物信息学分析、胁迫条件下表达差异、异源表达功能验证等方面有少量报道[29-31]，并未见直接研究ZmSnRK2与下游底物蛋白互作对ABA诱导响应的研究报道。为此，本研究以本课题组前期玉米磷酸化蛋白质组学分析鉴定出的238个响应ABA诱导且磷酸化水平上调的蛋白质为基础[32]，将其与拟南芥已知的SnRK2底物蛋白的序列进行比对，并检测SnRK2磷酸化保守基序(-RXXS-)的有无，预测可能的ZmSnRK2底物蛋白，并通过酵母双杂交(Yeast two-hydrid, Y2H)验证候选蛋白与ZmSnRK2家族成员的相互作用，以期揭示ZmSnRK2下游的ABA信号转导途径，进一步解析玉米中ABA介导非生物逆境抗性的分子机制。

1 材料与方法

1.1 响应ABA诱导的ZmSnRK2底物蛋白的筛选

以本课题组前期磷酸化蛋白质组学分析鉴定出的响应ABA诱导且磷酸化水平上调的238个蛋白质氨基酸序列为探针[33]，与已知的拟南芥SnRK2底物蛋白氨基酸序列进行本地Blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)比对，筛选与已知拟南芥SnRK2底物蛋白同源的ZmSnRK2候选底物蛋白。另外，利用Motif-X软件(http://motif-x.med.harvard.edu/motif-x.html)，从这238个蛋白中筛选包含保守基序-RXXS-的蛋白[23-25]。同时满足上述两项筛选条件的蛋白，即为预测的响应ABA诱导的ZmSnRK2候选底物蛋白。

1.2 克隆ZmSnRK2基因及候选底物蛋白编码基因

从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)和Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)数据库检索ZmSnRK2基因家族成员及编码候选底物蛋白的基因序列，据其用Premier 5软件(http://www.premierbiosoft.com/)设计PCR扩增引物，并在引物的5′端分别引入构建Y2H表达载体所需的限制性内切酶NdeⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ识别位点(表1和2)。

表1 扩增玉米ZmSnRK2基因的PCR引物Table 1 PCR primers for amplification of ZmSnRK2 genes of maize

注：下划线碱基CATATG、GAATTC、CTCGAG和GGATCC分别为NdeⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ识别位点。

Note:The underlined bases CATATG,GAATTC,CTCGAG and GGATCC indicate the recognition sites ofNdeⅠ,EcoR Ⅰ,XhoⅠ andBamH Ⅰ.

表2 扩增编码玉米ZmSnRK2候选底物蛋白基因的PCR引物Table 2 PCR primers for amplification of encoding genes of candidate ZmSnRK2 substrate proteins of maize

注：下划线碱基GAATTC和GGATCC分别为EcoRⅠ和BamHⅠ识别位点。

Note:The underlined bases GAATTC and GGATCC indicate the recognition sites ofEcoRⅠ andBamHⅠ.

取玉米模式自交系B73三叶期幼苗，用RNAiso Plus Kit(TaKaRa，大连)提取总RNA，加gDNA Eraser (TaKaRa，大连)去除可能的基因组DNA污染后，用PrimeScript®RT reagent Kit(TaKaRa，大连)反转录合成cDNA，并以此为模板，用高保真DNA聚合酶PrimeSTARTM HS DNA Polymerase(TaKaRa，大连)扩增ZmSnRK2基因家族成员和编码候选底物蛋白基因的开放阅读框(Open reading frame,ORF)序列。PCR扩增产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Tiangen，北京)回收，3′端加A后亚克隆至pMD19-T质粒，送上海生工生物工程股份有限公司测序。

1.3 酵母表达载体的构建

依据引物的酶切位点，用相应的酶分别双酶切插入ZmSnRK2基因家族成员的克隆载体pMD19-T(TakaRa，大连)和Y2H捕获载体pGADT7(丰辉生物，长沙)，用EcoRⅠ/BamHⅠ分别双酶切插入编码候选底物蛋白(Candidate substrate protein, Csd)基因的克隆载体pMD19-T和Y2H诱饵载体pGBKT7，酶切产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA回收试剂盒(Tiangen，北京)回收纯化酶切产物。用T4 DNA连接酶(TaKaRa，大连)分别将ZmSnRK2基因的ORF序列与捕获载体pGADT7及编码候选底物蛋白基因的ORF序列与诱饵载体pGBKT7连接，构建ZmSnRK2基因家族各成员的捕获载体pGADT7-ZmSnRK2和含有编码候选底物蛋白基因的诱饵载体pGBKT7-Csd。

1.4 酵母感受态细胞的制备

取酵母Y2H Gold菌株单菌落接种于YPDA液体培养基(蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L、葡萄糖20 g/L、腺嘌呤0.03 g/L，pH 5.8)，28 ℃培养至600 nm处吸光度(D600 nm)为0.6～0.8，转接到300 mL 新鲜的YPDA液体培养基中，30 ℃振荡培养至D600 nm为0.4～0.6，2 500 r/min离心5 min收集细胞，用50 mL 1×TE缓冲液重悬细胞，重复洗涤2次，细胞沉淀用1.5 mL 1×TE/LiAc重悬。

1.5 自体磷酸化的检测

在离心管中各加入100 μL酵母感受态细胞和600 μL PEG400 LiAc溶液，分别加入各候选底物蛋白基因诱饵载体pGBKT7-Csd 2.4 μL和空白捕获载体pGADT7 1.2 μL，混匀后30 ℃、200 r/min振荡培养30 min，然后每管加入70 μL二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)混匀，42 ℃热激15 min后迅速冰浴5 min，再12 000 r/min离心10 s，弃上清后每管加100 μL 1×TE重悬，涂布于SD二缺固体培养基SD/-Trp-Leu(SD琼脂无机盐46.7 g/L、-Leu/-Trp DO Supplement 0.64 g/L，pH 5.8)，30 ℃倒置培养3～7 d。挑取5个正常生长的单菌落，接种于1 mL SD二缺液体培养基SD/-Trp-Leu(SD无机盐26.7 g/L、-Leu/-Trp DO Supplement 0.64 g/L，pH 5.8)，30℃、200 r/min振荡培养至D600 nm为0.8～1.2。取6 μL培养液，涂布于加有半乳糖苷酶显色底物X-α-Gal的SD四缺固体培养基SD/-Ade-His-Trp-Leu/X-α-Gal(SD琼脂培养基46.7 g/L、-Ade/-His/-Leu/-Trp DO Supplement 0.60 g/L、X-α-Gal 5 mg/L，pH 5.8)，以转化pGBKT7-53和pGBKT7-Lam(丰辉生物，长沙)的酵母菌株分别为阳性和阴性对照，30 ℃倒置培养3～5 d，观察拍照并记录酵母菌斑生长及变蓝情况，分析候选底物蛋白是否存在自体磷酸化现象。

1.6 酵母双杂交

在离心管中各加入100 μL酵母感受态细胞和600 μL PEG4000 LiAc溶液，然后分别加入捕获载体pGADT7-ZmSnRK2和候选底物蛋白编码基因诱饵载体pGBKT7-Csd各2.4 μL，重复3次，混匀后30 ℃、200 r/min振荡培养30 min。按自体磷酸化检测的方法热激转化酵母感受态细胞并经二缺培养基筛选后，转接四缺培养基培养，观察记录菌斑生长及变蓝情况，分析各ZmSnRK2家族成员与候选底物蛋白之间是否存在相互作用。

2 结果与分析

2.1 响应ABA诱导的ZmSnRK2候选底物蛋白的筛选结果

以玉米中响应ABA诱导且磷酸化水平上调的238个蛋白质的氨基酸序列为探针，与拟南芥已知SnRK2底物蛋白的氨基酸序列进行本地Blastp比对，筛选出47个同源蛋白，注释功能涉及蛋白质可逆磷酸化、转录和翻译调控、能量代谢、细胞器转移、跨膜运输等众多生理生化过程(表3)。用Motif-X软件，从238个响应ABA诱导且磷酸化水平上调的蛋白中，筛选出23个包含保守基序-RXXS-的蛋白(表4)。同时满足这两项条件的蛋白有XP_008666965.1、NP_001183680.1、XP_008662247.1、NP_001167942.1、XP_008656995.1、NP_001152904.1、NP_001145831.1、NP_001149268.1、NP_001132279.1和NP_001142137.1共10个，其为预测的响应ABA诱导的ZmSnRK2候选底物蛋白。

表3 与拟南芥已知SnRK2底物同源的玉米蛋白Table 3 Maize proteins homologous to identified substrate proteins of SnRK2 in Arabidopsis

表3(续) Continued table 3

表4 含保守基序-RXXS-的玉米蛋白Table 4 Maize proteins containing conserved phosphorylation motif -RXXS- of SnRK2

表4(续) Continued table 4

2.2 ZmSnRK2基因家族ORF的扩增结果

以玉米总RNA反转录的cDNA为模板，用表1所列引物进行PCR扩增，得到ZmSnRK2基因家族11个生物信息学全基因组预测成员中的10个编码序列(图1)，测序结果表明，扩增到的序列完全正确，与Huai等[29]的定量PCR扩增结果一致；未得到ZmSnRK2.9的条带，因此认为ZmSnRK2.9可能是丧失表达能力的假基因。这10个ZmSnRK2基因家族包含ZmSnRK2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.10、2.11，其相关信息见表5。

M.DL2000 DNA Marker;1～10.分别为ZmSnRK2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.10、2.11基因的ORFM.DL2000 DNA marker;1-10.The ORFs of ZmSnRK2.1，2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.10,and 2.11,respectively图1 玉米ZmSnRK2基因ORF的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of ZmSnRK2 genes ORF of maize

2.3 编码ZmSnRK2候选底物蛋白基因的ORF扩增结果

以玉米总RNA反转录的cDNA为模板，用表2所列引物进行PCR扩增，得到8个编码ZmSnRK2候选底物蛋白基因的ORF(图2)。序列分析结果发现，编码序列号为NP_001145831.1的蛋白基因ORF序列第63碱基由C突变为T，致使第21个密码子由UGG同义突变为UGA，但仍编码甘氨酸。其余7个基因的ORF序列扩增结果完全正确(表6)。未扩增出编码基因的2个候选底物蛋白(XP_008662247.1和NP_001152904.1)均为功能未知的推导蛋白(表4)。

M1～M3.分别代表DL500，DL1000及DL2000 DNA Marker;1～8.分别为GenBank序列号为XP_008666965.1、XP_008656995.1、NP_001132279.1、NP_001183680.1、NP_001145831.1、NP_001149268.1、NP_001167942.1和NP_001142137.1蛋白的编码ORFM1-M3.Represent DL500，DL1000 and DL2000 DNA Marker,respectively;1-8.Indicate XP_008666965.1，XP_008656995.1，NP_001132279.1，NP_001183680.1，NP_001145831.1，NP_001149268.1，NP_001167942.1 and NP_001142137.1 proteins coding ORF

表6 玉米ZmSnRK2候选底物蛋白基因信息Table 6 Information of encoding genes of candidate ZmSnRK2 substrate proteins of maize

2.4 ZmSnRK2候选底物蛋白的自体磷酸化检测

图3结果表明，8个ZmSnRK2候选底物蛋白编码基因转化的酵母在二缺培养基(SD/-Trp-Leu)上均能长出菌落，说明全部转化成功。在添加半乳糖苷酶显色底物X-α-Gal的SD四缺培养基SD/-Ade-His-Trp-Leu上，转化编码序列号为XP_008666965.1、NP_001142137.1和XP_008656995.1的3个候选底物蛋白基因的酵母菌株，与阳性对照(pGBKT7-53)一样显现蓝色菌落，说明有自磷酸化现象发生，不能用Y2H检测其与ZmSnRK2的相互作用；转化编码其余5个预测底物蛋白基因的酵母菌株，与阴性对照(pGBKT7-Lam)一样未显现蓝色菌落，说明无自体磷酸化，可用Y2H检测其与ZmSnRK2的相互作用。

1～10.分别代表pGBKT7-NP_001149268.1、-NP_001132279.1、-NP_008666965.1、-NP_001142137.1、-NP_001167942.1、-NP_001183680.1、-NP_001145831.1、-XP_008656995.1、pGBKT7-53阳性对照及pGBKT7-Lam阴性对照载体1-10.represent pGBKT7-NP_001149268.1,-NP_001132279.1,-NP_008666965.1,-NP_001142137.1,-NP_001167942.1,-NP_001183680.1,-NP_001145831.1,-XP_008656995.1,pGBKT7-53 (Positive CK) and pGBKT7-Lam(Negative CK) vectors,respectively

2.5 ZmSnRK2与候选底物蛋白的相互作用

分别将8个ZmSnRK2基因捕获载体pGADT7-ZmSnRK2.1、2.2、2.4、2.5、2.7、2.8、2.10、2.11与5个编码无自体磷酸化的候选底物蛋白基因诱饵载体pGBKT7-Csd转化酵母，3次重复，共120个转化处理，结果酵母菌均可在二缺培养基SD/-Trp-Leu上生长，说明全部转化成功。如图4所示，在添加半乳糖苷酶显色底物X-α-Gal的四缺培养基SD/-Ade-His-Trp-Leu上，编码序列号为NP_001149268.1和NP_001132279.1的2个蛋白基因的诱饵载体pGBKT7-Csd与8个捕获载体共转化的酵母菌株均未显现蓝色菌落，说明这16个蛋白质组合之间无相互作用。编码序列号为NP_001183680.1蛋白基因的诱饵载体pGBKT7-Csd与8个捕获载体共转化的酵母菌株均显现蓝斑菌落，说明这8个蛋白质组合之间存在相互作用。编码序列号为NP_001145831.1的蛋白基因的诱饵载体pGBKT7-Csd与捕获载体pGADT7-ZmSnRK2.1共转化的酵母菌株及编码序列号为NP_001167942.1的蛋白基因的诱饵载体pGBKT7-Csd与捕获载体pGADT7-ZmSnRK2.10共转化的酵母菌株均显现蓝色菌落，说明这2个蛋白质组合之间存在相互作用。

3 讨论

Y2H结果证实，序列号为NP_001183680.1和NP_001167942.1的候选底物蛋白可与ZmSnRK2家族的成员相互作用，而这2个蛋白的磷酸化水平受ABA诱导而上调[32]，说明其可能是ZmSnRK2家族成员磷酸化的底物。其中，序列号为NP_001183680.1的蛋白在玉米中的功能未知，但其在拟南芥中的同源蛋白(AT1G69220)功能为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。序列号为NP_001167942.1的蛋白属于包含SAM(Sterile alpha motif)结构域的一类蛋白，涉及众多生理生化过程[33-36]。由此说明，在ZmSnRK2的下游ABA信号转导呈发散状，有待进一步深入研究。