， ， ，，，顺棠，

(1.天津科技大学 生物工程学院，天津 300457；2.莲花健康产业集团股份有限公司 博士后科研工作站，河南 项城 466200)

甜菜碱是甘氨酸的三甲基化衍生物，几乎存在于所有的生物体中.自从1982年Galinski等[1]首次报道细菌Halorhodospirahalochloris利用甜菜碱之后，在许多微生物中相继发现了甜菜碱的生物合成和利用.大多数嗜盐细菌和耐盐细菌，包括一些生活在高渗环境中的光合自养蓝藻和硫细菌，可以合成甜菜碱并用作有效的渗透剂[2].大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和球形节杆菌等异养细菌也可以自身合成甜菜碱[3].大多数异养细菌不能合成甜菜碱，但可以吸收和利用环境中的甜菜碱对抗渗透胁迫，例如在根瘤菌科Rhizobiaceae家族发现的代表性菌株[4].最近，在真菌类微生物中也发现了甜菜碱的生物合成途径.在烟曲霉中，甜菜碱不参与应激调节，仅在胆碱分解代谢中起着代谢中间体的作用，并可用作营养物质[5].甜菜碱不仅对天然微生物群有功效，而且对工业微生物发酵也有显著效果.甜菜碱的使用提高了工业生产过程中菌株的发酵性能，例如，甜菜碱的添加可以有效提高乳酸菌在脱水、贮存和复溶过程中的存活率[6].总之，微生物普遍将甜菜碱作为一种应激保护剂或关键代谢中间体加以利用.在这篇综述中，笔者总结了多种微生物中甜菜碱的生物合成、转运和分解代谢的共同特征.此外，本综述提供了甜菜碱在微生物发酵中的最新研究进展，并讨论了其在生物技术领域的应用前景.

1 微生物中甜菜碱的生物合成途径

与动植物类似，大多数微生物通过利用两种酶(胆碱脱氢酶和甜菜碱醛脱氢酶)两步氧化胆碱合成甜菜碱(图1).然而，在微生物中已经鉴定出另一种生物合成途径，即利用甘氨酸经过三步甲基化合成甜菜碱(图1)，在动植物相关研究中尚未有该途径的报道.

图1 微生物中甜菜碱的生物合成途径Fig.1 Biosynthesis of betaine in microorganisms

1.1 胆碱氧化途径

在大多数微生物细胞中甜菜碱通过胆碱两步氧化法合成.不同微生物中，第一步氧化反应涉及的酶(催化胆碱到甜菜醛)是具有多样性的.在大肠杆菌中，胆碱脱氢酶催化胆碱的第一步氧化反应，该酶与膜结合，需要FAD参与并使用氧作为电子受体[7].在枯草芽孢杆菌中，第一步氧化反应则由不同的胆碱脱氢酶催化，该酶为NAD+依赖的III型醇脱氢酶，利用NAD+作为电子受体[3].在烟曲霉中，胆碱氧化酶催化第一氧化步骤，并使用氧作为电子受体[5].

相比之下，不同微生物中第二步氧化反应涉及的酶是相对保守的.在细菌和真菌中广泛存在可溶性的NAD+依赖的甜菜醛脱氢酶，该酶可以使用NAD+作为电子受体将甜菜醛氧化成甜菜碱[3,5,7].

1.2 甘氨酸甲基化途径

一些微生物可以通过甘氨酸甲基化合成甜菜碱(图1).体外14C标记实验表明：S-腺苷甲硫氨酸可以作为甲基供体用于甘氨酸到肌氨酸，肌氨酸到二甲基甘氨酸以及二甲基甘氨酸到甜菜碱的转化过程[9].该途径已经在古细菌Methanohalophilusportucalensis、蓝藻Aphanothecehalophytica、光致硫细菌Ectothiorhodospirahalochloris、嗜盐放线菌Actinopolysporahalophile、嗜盐光养菌H.halochloris和蓝细菌Synechococcussp.WH8102中发现.已经从上述微生物中分离并鉴定出甘氨酸甲基化反应涉及的三种酶，包括甘氨酸肌氨酸甲基转移酶(GSMT)、肌氨酸二甲基甘氨酸甲基转移酶(SDMT)和二甲基甘氨酸甲基转移酶(DMT)[10-12].

从甘氨酸合成甜菜碱是微生物中罕见的代谢途径，因为甲基化反应是自然界中最耗能的过程之一，如S-腺苷甲硫氨酸的一分子活性甲基的形成需要消耗细胞12分子的ATP[13].在微生物体内存在如此耗能的途径可能与以下原因有关：1) 一些甜菜碱依赖性的厌氧微生物不能进行氧依赖性胆碱氧化，例如嗜盐甲烷菌M.portucalensis无法在胞内进行胆碱的氧化；2) 一些甜菜碱依赖性的微生物不表达胆碱氧化酶基因，如光合细菌E.halochloris；3) 一些极端嗜盐微生物同时含有胆碱氧化和甘氨酸甲基化途径，例如嗜盐放线菌在胆碱含量较低的环境中可以使用耗能的甲基化途径紧急合成甜菜碱.

2 微生物中甜菜碱的转运途径

甜菜碱及其前体胆碱是自然界中普遍存在的化合物.这些化合物被微生物利用于抵御环境胁迫[14].考虑到甜菜碱合成需要消耗能量，从环境中直接摄取甜菜碱是一种更为经济合理的方式.

细菌和古细菌演化出一整套运输甜菜碱等相容性溶质的转运系统，以满足不同环境下的生理需求.由于甜菜碱和其他相容性溶质的主要功能为渗透保护，所以这些转运系统通常在高渗透压下才会发挥作用.渗透压的变化会引起相关基因的转录变化.其中，一些转运系统可能对特定的底物(包括甜菜碱等)表现出高亲和力，而一些转运系统则展现出广泛的底物特异性并允许细胞利用环境中存在的一系列相容性溶质[15].表1中总结了两类代表性的甜菜碱转运蛋白、初级转运蛋白(也称ABC转运蛋白)和次级转运蛋白.

表1 微生物中的甜菜碱转运蛋白Table 1 Betaine transporters in microorganisms

3 微生物中甜菜碱的分解代谢途径

微生物中存在不同的甜菜碱分解代谢途径，其中最为普遍的是通过甲基转移将甜菜碱转化为甘氨酸(导致甲基基团向甲硫氨酸循环供应).此外，一些微生物如梭菌Clostridiumsporogenes和深海微生物可以将甜菜碱还原为乙酸根和三甲基胺(Stickland反应)[30].而有些微生物甚至可以利用甜菜碱作为唯一的碳源和氮源使用[31].

3.1 甜菜碱在甲基代谢中的作用

微生物中存在甲硫氨酸循环，该循环最终能够将甲基从甲硫氨酸转移到甲基受体.如图1所示，甲硫氨酸首先转化为甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，然后再将甲基转移至甲基受体.甲基转移后，SAM降解为S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，随后降解为高半胱氨酸(HC).HC则可以与甜菜碱反应重新形成甲硫氨酸.该反应以甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)作为催化剂，将甜菜碱中的甲基转移到HC形成甲硫氨酸，甜菜碱脱甲基后形成二甲基甘氨酸.BHMT依赖的甜菜碱分解代谢在自然界中广泛存在，在细胞甲基代谢中发挥重要作用.

BHMT作为甜菜碱分解代谢的关键酶已被广泛研究，其中来源于哺乳动物的BHMT为扭曲桶状的锌结合酶[32]，尽管在微生物中已经证明存在BHMT，但是其编码基因很少能够被鉴定出来，这可能是由于哺乳动物BHMT和微生物BHMT之间的相似度极低.只有一种来自中华根瘤菌的BHMT基因与来源于哺乳动物BHMT基因具有较高的相似度[33],而其他微生物来源的BHMT基因，例如农杆菌Agrobacteriumtumafaciens和绿脓假单胞菌Pseudomonasaeruginosa，与哺乳动物来源的BHMT基因相比没有同源性[31].据报道，在脱硫杆菌中存在一种不同类型的甜菜碱甲基转移酶(三甲胺甲基转移酶家族)，可以通过四氢叶酸(THF)中间体将甲基氧化成二氧化碳，同时将甜菜碱脱甲基化形成二甲基甘氨酸[34].此外，甜菜碱代谢与氨基酸代谢和中心代谢有关.二甲基甘氨酸可以进一步分解成肌氨酸和甘氨酸，甘氨酸可进一步代谢产生丙酮酸产物[35].因此，某些需氧菌，如假单胞菌，可以通过甜菜碱来合成许多细胞组分[31].

3.2 其他分解代谢途径

有些微生物演化出特殊的甜菜碱分解代谢途径.例如，胆碱氧化为甜菜碱原本是不可逆的催化反应，然而，对青霉Penicilliumfellutanu和构巢曲霉Aspergillusnidulans的代谢研究表明甜菜碱可以转化为甜菜碱醛并进一步被还原成胆碱[36-37].这种从甜菜碱到胆碱的特殊还原途径进一步揭示出胆碱在真菌中的基本功能，但甜菜碱在该途径中的生物化学和分子代谢过程仍有待阐明.

甜菜碱也可以被分解为其他功能性营养物质.例如，通过Stickland反应，甜菜碱可以在甜菜碱还原酶的作用下转变为乙酸盐和三甲胺.三甲胺是某些微生物生长所必需的营养物质，如Methanosarcina属的菌株.最近的一项研究结果表明，协作性的原核生物群体能够利用甜菜碱分解形成的功能性营养物质适应最恶劣的环境[30].

4 甜菜碱在微生物发酵中的应用

甜菜碱已经成功应用于应用微生物学和生物技术领域.甜菜碱主要用作应激保护剂或细胞内酶的稳定剂以抵抗胁迫条件.同时，甜菜碱也被用来作为甲基化反应的甲基供体.在大多数情况下，培养基中甜菜碱的补充不会显著提高生产成本或改变发酵过程.甜菜碱可以从丰富的自然资源中获得，价格约为1 200 美元/吨.考虑到其添加量低(约1～2 g/L)，单位成本相当低，无需复杂的预处理就可以直接添加到培养基中.然而，甜菜碱目前仅应用于少数的微生物反应过程，如表2所示.随着对微生物中甜菜碱功能和甜菜碱代谢的进一步了解，预计其在微生物发酵工业中的应用将会扩大.

表2 甜菜碱在微生物发酵中的应用Table 2 Application of betaine in microbial fermentation

4.1 细胞渗透调节物质

作为最普遍的渗透剂之一，甜菜碱可以提高微生物细胞的渗透耐受性，因为它可以在细胞内高浓度积累(通过运输或生物合成)，从而平衡细胞内外的渗透压力.甜菜碱可以增加脱水和补液期间微生物细胞的存活率，在早期应用甜菜碱时，利用该性质来保护储藏和活化过程中的工业微生物菌株.另一个有效策略是在发酵培养基中补充甜菜碱.如已报道的在乳酸盐、乙醇、赖氨酸和丙酮酸盐的发酵中添加甜菜碱，可以增加细胞生长速率，并且可以改善高渗胁迫条件(高浓度碳水化合物底物或产物)下菌株的发酵性能(表2).

4.2 酶保护剂

甜菜碱不仅可以保护整个细胞，还可以保护各种细胞内成分免受环境压力，包括应激敏感的蛋白质和酶.例如，甜菜碱对天然蛋白质提供热保护，并有益于大肠杆菌细胞中应激诱导的蛋白质聚集体的恢复[44].另一项研究发现甜菜碱可以克服脱水或渗透胁迫下蛋白质拥挤的不稳定作用[45].此外，微生物发酵中添加甜菜碱是有效的，因为发酵过程存在渗透胁迫，而代谢关键酶对渗透胁迫是敏感的.甜菜碱可以增加乳酸、赖氨酸和支链淀粉酶发酵中关键酶的活性，从而提高这些产品的产量(表2).此外，最新研究表明，甜菜碱及其类似物对各种酶如葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、乳糖脱氢酶、硫酸酯酶和辣根过氧化物酶都具有保护作用，这些酶在冻融之后大部分活性得到保留[46].

4.3 甲基供体

SAM依赖性和甲基转移酶介导的甲基化反应常常发生在结构复杂的天然化合物的生物合成中，因为它们的化学结构中通常有一个或多个甲基.通过甲基转移来补充相应的甲基供体可以提高这些天然化合物的产量.例如，补充甜菜碱可以显著改善硝酸假单胞菌维生素B12的工业发酵[43]，因为维生素B12在其最终结构中含有8个甲基.与铜绿假单胞菌类似[31]，生产维生素B12的脱氮硝酸菌也含有有效的甜菜碱分解代谢途径，可以从甜菜碱中除去甲基，随后将甲基用于甲硫氨酸，SAM和维生素B12的合成中.在维生素B12的生产中，甜菜碱不断流加到培养基中用于分解代谢，其添加量约为甜菜碱用于细胞渗透调节或酶保护剂时的10倍.这种添加量的差异进一步证明甜菜碱在维生素B12生产中可作为甲基供体.然而，这种应用在微生物中并不多见，因为只有很少的微生物具有甜菜碱的天然分解代谢途径.

5 结 论

甜菜碱由于具有优良的生物相容性、合理的碳氮比和高丰富度而成为重要的渗透调节物质、甲基供体以及微生物的直接营养物质.在这篇综述中，总结了微生物中甜菜碱代谢的途径、转运蛋白和关键酶，为甜菜碱的研究提供了最新的概述.随着甜菜碱分解代谢途径的不断剖析，其可以被设计到已知的微生物工程菌株中来增强甲基代谢，使微生物能够更加高效的生产某些结构复杂的次级代谢产物.甜菜碱独特的生物相容性及生理活性将使其在生物技术领域具有广阔的应用前景.