杨 帆,苏卜利,姚 青,李华平,朱红惠,*

(1.广东省微生物研究所,广东省菌种保藏与应用重点实验室,广东省微生物应用新技术公共实验室,省部共建华南应用微生物国家重点实验室,广东广州 510070;2.华南农业大学农学院,广东广州 510642；3.华南农业大学园艺学院，广东广州 510642)

番茄红素是一类含有40个碳原子的类胡萝卜素,不仅具有很高的营养价值,而且具有保健功效,尤其是具有较高的抗氧化能力,能防治血管硬化、抗衰老及抑制癌细胞生长,在食品加工、医药保健、化妆品等行业用途十分广泛[1]。目前,番茄红素的生产方法主要包括以下几种:a.天然产物提取获得[2],例如从胡萝卜、番茄等富含色素的植物中提取;b.利用化学法对番茄红素进行全合成[3];c.采用三孢布拉氏霉菌、杜氏盐藻、红法夫酵母等天然具有番茄红素合成能力的微生物进行发酵生产[4]。但这三种方法都有相应的不足之处,如天然提取成本较高,化学合成会产生副产物,天然菌株产量较低,故应用基因工程将外源基因导入模式菌株,利用模式菌株繁殖快、产量高、遗传改造方便等特点制造番茄红素是番茄红素生产的主要发展方向[5]。和其他萜类化合物一样,番茄红素是以异戊烯焦磷酸(IPP)作为前体进行合成[6]。在自然界,有两种途径合成:MVA途径和MEP途径[7-9]。

异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)和脱氧木酮糖磷酸合成酶(1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase,DXS)是合成番茄红素等萜类化合物的关键催化酶,也是代谢工程对萜类化合物合成途径改造的最重要的靶点之一[10]。IDI编码大肠杆菌代谢途径中的IPP异构化酶,能够促进1PP向DMAPP的转化[11],通过在大肠杆菌中过表达idi基因，能够有效提高番茄红素产量。IDI在基因序列及反应机制上可以分为两类,但两类IDI在代谢改造中促进番茄红素合成的作用仍不清楚。DXS编码脱氧木酮糖磷酸合成酶,主要催化丙酮酸和三磷酸甘油醛之间的反应[12]。IDI、DXS在萜类化合物代谢途径中发挥着重要的作用,不同来源IDI、DXS对工程菌株产番茄红素的作用也各不相同。目前工程菌株中强化IDI、DXS的策略往往局限在大肠杆菌来源等自身不能生产番茄红素的少数候选基因,而许多产番茄红素菌株的IDI、DXS并没有得到表征。

本课题组有一株能在极端环境下生存的戈壁奇球菌(Deinococcusgobiensis),该菌株菌落为红色,基因组中含有合成番茄红素的CrtE、CrtB和CrtI基因,通过生物信息学分析调取相关基因,经过密码子优化构建了合成番茄红素的重组大肠杆菌。通过对不同来源IDI、DXS进行异源过表达,探索其对工程菌株合成番茄红素能力的影响。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

表1 本研究使用的菌株和质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

Nexus GSX1 PCR仪 德国Eppendorf公司;5452型离心机 德国Eppendorf公司;1645050型电泳仪 北京六一生物科技有限公司;ChemiDoc MP凝胶成像系统 美国BIO-RAD公司;1200型高效液相色谱(HPLC) 美国安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 目的基因的克隆 根据大肠杆菌密码子的偏好性,将戈壁奇球菌基因组中含有合成番茄红素的CrtE、CrtB和CrtI基因进行密码子优化，并添加合适的RBS位点,全基因合成CrtEBI基因。

以实验室保存的基因组或空载体为模版,按表2中相应的配对引物,分别扩增得到载体pTrc99a、pACYCDuet-1片段,以及ECIDI、BSIDI、MXIDI、IOIDI和ECDXS、BSDXS、MXDXS、IODXS目的片段。其中,pTrc99a、pACYCDuet-1、E.C、B.S等基因的PCR扩增条件为:95 ℃预变性5 min;98 ℃变性10 s;55 ℃退火15 s;72 ℃延伸30 s;共进行30个PCR循环;最后在72 ℃继续延伸10 min;M.X、I.O基因使用扩增高GC基因的PrimeSTAR® HS DNA Polymerase with GC Buffer进行扩增,PCR条件分别将退火温度改为60、68 ℃。

表2 本研究使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2.2 表达载体构建 将获得的目的基因与载体片段进行琼脂糖凝胶电泳,回收条带。使用CPEC[13]的方法将CrtEBI基因与pTrc99a进行连接,并分别将不同IDI、DXS与pACYCDuet-1载体进行连接,构建重组质粒。连接体系为:目的基因与载体各2.5 μL、Primer Star Max DNA polymerase 5 μL。连接条件为:98 ℃预变性3 min;98 ℃变性10 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸1 min后转化E.coliDH5α。含pTrc99a载体的重组质粒在含34 mg/L氯霉素抗性的平板上进行筛选,含pACYCDuet-1载体的重组质粒在含100 mg/L氨苄青霉素抗性的平板上进行筛选。在37 ℃培养箱中培养约12 h后，挑取单菌落进行菌落PCR验证,验证引物为pTrc99a、pACYCDuet-1测序引物。将验证正确的菌体在37 ℃摇床中培养约12 h后,使用质粒提取试剂盒提取质粒,送上海美吉公司进行测序,经测序正确的重组质粒分别命名为pTrc99aEBI、pACECIDI、pACBSIDI、pACMXIDI、pACIOIDI;pACECDXS、pACBSDXS、pACMXDXS、pACIODXS。

1.2.3 重组质粒的诱导表达 分别将质粒pACECIDI、pACBSIDI、pACMXIDI、pACIOIDI、pACECDXS、pACBSDXS、pACMXDXS、pACIODXS与含有番茄红素合成基因的pTrc99aEBI质粒共同转入E.coliBL21(DE3)中,同时以空pACYC质粒作为对照。在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上进行筛选,得到相应的重组菌株。

挑取单克隆至5 mL含有氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基,在37 ℃摇床中培养,待菌体长至OD600值大约1后,转接至50 mL含有100 mg/L氨苄青霉素和34 mg/L氯霉素的LB液体培养基中。待菌体OD600值达到0.6～0.8时,用一定浓度的IPTG进行诱导,同时以未诱导的培养基作为对照,约20 h后检测番茄红素含量。

1.2.4 IDI与DXS的协同表达 根据大肠杆菌密码子的偏好性,将粘细菌中的IDI及DXS进行优化,并通过全基因合成得到idi-dxs基因。通过CPEC方法将idi-dxs基因与载体片段pACYC进行连接,获得质粒pACMYIDI-DXS。将质粒pACMYIDI-DXS与含有番茄红素合成基因的pTrc99aEBI质粒共同转入大肠杆菌BL21(DE3)中,得到相应的重组菌株。

1.2.5 番茄红素的提取与测定 番茄红素的提取与测定参照Sun等[14]方法。具体操作:取3 mL在LB液体培养基中培养至一定时期的菌液,5000 r/min离心3 min弃上清液;用无菌水清洗两次,加3 mL丙酮,于55 ℃水浴锅中萃取15 min,5000 r/min离心5 min，取上清即为番茄红素萃取液,保留上清液以备检测。另外取9 mL培养液于8000 r/min 离心5 min后弃上清液,沉淀于70 ℃中烘干,然后计算菌体干重。

考察学习中，考察团一行先后来到长治市武乡八路军纪念馆和平顺县，进行重温入党誓词，并听全国劳动模范申纪兰老人上党课，接受爱国主义教育。同时结合此行考察重点，考察团还对长治市几个乡、县的种植、养殖合作社、集体经济示范村、乡村旅游示范点的运营管理、农村“两委”建设、民主管理、村委会民主监督等典型经验进行了学习和交流。对长治市城区相关社区基层党建和社会管理工作进行了深入了解。

番茄红素含量的测定使用高效液相色谱仪(HPLC)。色谱柱:反相色谱柱C18;流动相为乙腈∶甲醇∶异丙醇(80∶15∶5,v∶v∶v),流速1.2 mL/min,检测波长为472 nm,柱温40 ℃,进样量10 μL。使用番茄红素标准品制作标准曲线,通过稀释番茄红素母液,配制了以下浓度番茄红素样品:18、16、14、12、6、4、2、1 mg/L,根据相应浓度番茄红素样品对应的峰面积,可以得到其标准曲线为:Y=0.0286X-0.1968,R2=0.9972,根据标准曲线计算番茄红素的产量。

1.2.6 培养条件的优化

1.2.6.1 不同诱导剂浓度对菌株生产番茄红素的影响 以LB培养基为基础培养基,以含有pACMXDXS与pTrc99aEBI的菌株为优化对象。待菌体OD600值达到0.6～0.8时,用IPTG进行诱导,选用诱导剂终浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.2 mmol/L。

1.2.6.2 不同诱导时间对菌株生产番茄红素的影响 以LB培养基为基础培养基,以含有pACMXDXS与pTrc99aEBI的菌株为优化对象。待菌体OD600值达到0.6～0.8时,用IPTG进行诱导,选取诱导剂添加时间分别为2、3、4、5 h。

1.2.6.3 不同培养时间对菌株生产番茄红素的影响 以LB培养基为基础培养基,以含有pACMXDXS与pTrc99aEBI的菌株为优化对象。选取菌株培养时间分别为12、18、24、30 h提取番茄红素。

1.3 数据处理

以上实验分别重复2次,实验数据处理采用Microsoft Office Excel 2007。

2 结果与分析

2.1 不同来源IDI基因与DXS基因的获得

以本实验室保存的基因组为模板,依次用表1中的引物,分别对ECIDI、BSIDI、MXIDI、IOIDI和ECDXS、BSDXS、MXDXS、IODXS各种来源的目的基因进行PCR扩增,已知的各个基因大小分别为549、1050、1059、912、1863、1902、1752、1845 bp。PCR结果与各个基因的大小吻合,所得的核酸电泳图如图1所示。

图1 不同来源IDI、DXS PCR扩增产物核酸电泳图Fig.1 Nucleic acid electrophoresis of the different IDI and DXS’s PCR products注:M.marker;1.ECIDI;2.BSIDI;3.MXIDI;4.IOIDI;5.ECDXS;6.BSDXS;7.MXDXS;8.IODXS。

2.2 重组质粒的构建

将合成番茄红素CrtEBI基因及不同来源的4种idi、dxs基因分别插入质粒pTrc99a、pACYC,构建合成番茄红素的99aEBI质粒及含有idi、dxs基因的多种质粒。将该质粒转化E.coliDH5α,待培养后提取质粒送测序,测序结果用软件Vector NT1进行比对,结果表明各个质粒均构建成功。

2.3 重组质粒的过表达及其对番茄红素产量的影响

将含有番茄红素合成基因的质粒与新构建的含有IDI、DXS的质粒共同转入E.coliBL21(DE3)中,获得含不同来源功能基因的菌株。重组菌株培养离心结果如图2,表明过表达DXS和IDI后重组菌产番茄红素能力有所提升。在过表达不同来源IDI、DXS基因后,重组菌株番茄红素产量得到了不同程度的提高,结果如图3、图4。在重组菌株中,目的基因来源于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、粘细菌的菌株番茄红素产量都有一定提升,添加诱导剂后，番茄红素产量要明显高于未添加诱导剂。

图2 过表达DXS和IDI重组菌产番茄红素情况Fig.2 Production of lycopene by strain with IDI注:A.对照菌株;B.过表达DXS的重组菌株;C.过表达IDI的重组菌株。

图3 不同来源IDI对番茄红素产量的影响Fig.3 Effects of IDIs on lycopene production 注:+表示添加IPTG进行诱导;图4同。

图4 不同来源DXS对番茄红素产量的影响Fig.4 Effects of DXSs on lycopene production

表达ECIDI、BSIDI、MXIDI、IOIDI的菌株番茄红素产量分别可以达到4.23、4.87、5.28、3.23 mg/g DCW。添加诱导剂IPTG后的菌株番茄红素产量分别达到6.55、8.24、10.86、3.70 mg/g DCW,其中最高的M.XIDI比没有转化IDI的对照菌株产量(3.58 mg/g DCW)提高了约2.0倍。

表达ECDXS、BSDXS、MXDXS、IODXS的菌株番茄红素产量分别可以达到4.88、2.79、3.18、3.03 mg/g DCW。添加诱导剂IPTG后的菌株番茄红素产量分别达到5.19、4.33、7.94、4.07 mg/g DCW,其中最高的MXDXS比没有转化DXS的对照菌株产量(3.58 mg/g DCW)提高了约1.2倍。

2.4 IDI与DXS的协同表达对番茄红素产量的影响

以上结果表明,相对于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等菌株,来自粘细菌的IDI、DXS对MEP途径的强化具有更明显的作用。为了构建高水平合成番茄红素的大肠杆菌工程菌株,将粘细菌IDI及DXS进行密码子优化获得idi-dxs基因。通过协同表达IDI和DXS来进一步提高番茄红素的合成水平。将质粒pACMYIDI-DXS和pTrc99aEBI转化到E.coliBL21(DE3)中,获得高水平合成番茄红素的菌株。在LB培养基中培养3 h后，添加IPTG进行诱导,约20 h后提取番茄红素。在协同表达IDI、DXS后,重组菌株番茄红素产量得到最高,达到15.26 mg/g DCW,比没有转化IDI、DXS的对照菌株产量(3.58 mg/g DCW)提高了约3.3倍。

2.5 培养条件的优化

2.5.1 不同诱导剂浓度对菌株生产番茄红素的影响 添加诱导剂可显著影响菌株生产番茄红素的能力。从图5可以看出，工程菌在添加了不同浓度的诱导剂培养时,番茄红素含量并没有明显差异,但终浓度为0.1、0.2 mmol/L的效果要稍好于其它浓度。

图5 不同诱导剂浓度对番茄红素产量的影响Fig.5 Effects of different inducerconcentration on lycopene production

2.5.2 不同诱导时间对菌株生产番茄红素的影响 菌株生长到不同时间添加诱导剂可显著影响菌株生产番茄红素的能力。从图6可以看出,菌株在生长3 h添加诱导剂时,番茄红素含量最高,效果明显好于其它时间。因此确定工程菌培养最适宜的诱导剂添加时间为培养3 h。

图6 不同诱导时间对番茄红素产量的影响Fig.6 Effects of different inducer time on lycopene production

2.5.3 不同培养时间对菌株生产番茄红素的影响 不同发酵时间对于番茄红素产量有着明显的影响,从图7可以看出,工程菌在培养24 h左右,番茄红素含量达到最高。因此确定工程菌培养最适宜的发酵时间为24 h。

图7 不同培养时间对番茄红素产量的影响Fig.7 Effects of different incubation time on lycopene production

3 讨论与结论

为达到利用大肠杆菌高效生产番茄红素的目的,需要对番茄红素的代谢途径进行改造和优化[15]。其中,通过过表达番茄红素代谢途径中的关键酶基因,可以有效提高番茄红素产量。IDI、DXS是合成番茄红素等萜类化合物的关键催化酶,也是代谢工程对萜类化合物合成途径改造的最重要的靶点之一[16]。Rad等[17]报道，II型IDI在大肠杆菌工程菌株中更有利于番茄红素的合成,通过过表达II型枯草芽孢杆菌idi基因,将番茄红素产量提高了约1.6倍;韩莉等[18]对2类IDI进行了系统性分析,通过优化多靶点组合及转化时间将番茄红素的产量提高到10.29 mg/g DCW。翁志明[19]通过对dxs基因启动子的置换将番茄红素的产量提高到15.6 mg/g DCW。本研究中,选取了典型的大肠杆菌及枯草芽孢杆菌IDI、DXS作为对照,选取了本身能生产番茄红素的戈壁奇球菌和粘细菌的IDI、DXS,比较了不同来源IDI、DXS对番茄红素产量的影响。

本研究结果显示,II型的枯草芽孢杆菌idi基因对重组大肠杆菌合成番茄红素能力的促进效果要优于I型的大肠杆菌idi基因,这与文献[20]报道所一致,但其dxs基因的促进效果要比大肠杆菌差。而来自粘细菌的idi基因和dxs基因的促进效果都优于枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。在发酵培养24 h后,番茄红素产量达到10.86、7.94 mg/g DCW。协同表达经过优化后的idi-dxs基因,番茄红素产量达到了15.26 mg/g DCW,比对照菌株提高了约3.3倍。由此可以说明,来自粘细菌的idi、dxs基因优于代谢工程改造中常用的基因。目前还未见报道利用粘细菌来源基因优化MEP途径,提高番茄红素产量。这为后续代谢工程改造提供了新的基因资源。

为了进一步提高番茄红素产量,下一步的工作考虑把产番茄红素基因及idi基因、dxs基因整合到基因组上,同时尝试不同的启动子和RBS位点来改造和优化代谢途径。另外,进一步对产番茄红素工程菌株进行培养条件的优化及高密度发酵培养,来提高番茄红素产量。