王鹏跃,曾议霆,李小军

(1 成都农业科技职业学院,四川成都 611130;2.成都产品质量检验研究院有限责任公司,四川成都 610100;3.成都天河中西医科技保育有限公司,四川成都 610041)

D-甘露醇即虫草酸具有利尿脱水、提高血浆渗透压、抗氧化、抗衰老、镇咳、祛痰和平喘等多种功效[1-3],是虫草及其制品中真正起药效和保健作用的最重要的成分之一,是虫草的一个特征标识[4-5],是评价虫草及其制品质量品质的重要指标[6-8]。

现有天然虫草资源极度匮乏,人们除了对天然虫草资源高效利用外,也在积极进行人工引种栽培,并利用丰富的现代加工技术手段制得广泛的虫草制品[9],以实现虫草资源的效益最大化,当然市场上也大量存在伪劣及假冒的虫草及其制品,因而市场管理必须介入。市场管理,科学地培育人工虫草,虫草及虫草制品的研究、加工与质量控制等都需要以准确检测、识别其有效成分为前提[10]。目前对天然或人工培养虫草与虫草相关制品中D-甘露醇的检测已有大量研究,检测方法如容量法、UPLC-MS/MS、TLC、GC-MS等,但缺乏系统地方法研究与评述,虫草制品往往成分复杂,检测时干扰因素较多,目前尚缺乏商业化标准,且没有对虫草及相关制品细分产品如保健功能食品、医药制品及其他制品等D-甘露醇检测的特定的行之有效的方法。因此了解虫草及其制品中D-甘露醇检测技术的研究进展,对于现有D-甘露醇检测技术的完善或开发新型检测方法具有重要意义,本文通过对虫草及其制品中D-甘露醇检测技术的综述,以期对现有D-甘露醇检测技术的完善或开发新型检测方法提供理论指导,同时为虫草及其制品的质量监控,虫草及其制品用于功能食品、保健食品及医药的进一步开发研究及相关细分检测标准的制定提供参考。

1 D-甘露醇检测方法

1.1 容量分析法(Volumetric analysis,VA)

容量分析法,别称容量法、剩余滴定法,是利用D-甘露醇的还原性,以高碘酸钠作为氧化剂进行滴定的方法,也称氧化还原滴定法,该法收载于我国各版本药典中,用于测定冬虫夏草及由虫草作为主要成分制作的药品中的D-甘露醇的含量[11-14]。

邓亮等[15]采用VA测定不同生产条件下制得的虫草菌丝中D-甘露醇的含量,表明生产条件对D-甘露醇含量影响较大。检测方法为:以乙醇热回流提取样品,滤液中加入高碘酸钠溶液,置水浴加热氧化,随后加入碘化钾试液略微放置,用硫代硫酸钠滴定液(0.05 mol/L)滴定,快到终点时,加入淀粉指示液,再滴定至蓝色消失,空白校正,硫代硫酸钠滴定液(0.05 mol/L)对D-甘露醇(C6H14O6)的滴定度为0.9109 mg。该法简便易行,但诸多研究表明,VA检测结果较真实值偏大,主要是由于具有其他还原性成分的干扰,且误差较大,适用于较纯的D-甘露醇制剂[16-17]。

1.2 薄层色谱法(Thin layer chromatography,TLC)

旺宝琪等[18]首次使用TLC检测虫草中D-甘露醇的含量。以95%乙醇在沙氏提取器中回流提取虫草样品得D-甘露醇提取液,以复合展开剂展开后,用高碘酸钾-联苯胺显色,在λS=295 nm、λR=370 nm的条件下进行双波长反射锯齿形扫描,测得西藏产冬虫夏草中D-甘露醇的含量为8.4%,回收率为98.0%～101.6%,RSD为0.60%。此后,鲜有用该法测定虫草或虫草制品中D-甘露醇含量的情形,许妍等[19]、陈策等[20]使用TLC对虫草菌粉制品金水宝片剂、人工蛹虫草等中的D-甘露醇进行定性分析,均未进行定量测定。之后,未见对此方法的报道,可能是由于TLC测定D-甘露醇对点样操作、点样剂等要求较高,误差大[21]。

1.3 分光光度法(Spectrophotometry,SP)

刘桂君等[22]以SP测定了分别以燕麦、小米、大麦、大米为培养基质形成的蛹虫草子座中D-甘露醇的含量,检测结果判定小米和大麦适合于人工培养高产虫草素、D-甘露醇的蛹虫草子座。李妍等[23]通过SP测定蛹虫草保健酒中D-甘露醇的含量,并以响应曲面方法对基酒提取人工蛹虫草子实体中D-甘露醇的工艺进行优化,结果表明投料比1∶55,基酒40% vol,蛹虫草原粒度,提取1 d,提取过程中氮吹搅拌10 min 提取工艺下,SP测得的D-甘露醇含量最大。王晓玲等[3]通过SP监测液体深层发酵技术生产的菌丝粉中D-甘露醇含量的动态变化特征,并建立了生产蛹虫草D-甘露醇的发酵动力学模型。其以蒸馏水回流提取菌丝粉中的D-甘露醇,先后加入高碘酸钠、L-鼠李糖、Nash试剂,在413 nm处比色测定D-甘露醇的含量。

XIAO等[24]建立了酶标仪-分光光度法(40 ℃水浴提取)用于多种药用冬虫夏草D-甘露醇的测定,该法具有成本低、效率高、可大批量检测等特点。之后,蒋永红等[25]从方法学角度验证了酶标仪-分光光度法测定虫草菌丝共生体中D-甘露醇含量的可靠性。用30%乙醇水浴(35 ℃)提取D-甘露醇,先后加入高碘酸钠、L-鼠李糖、Nash试剂,53 ℃水浴生成黄色的3,5-二乙酰-1,4-脱氢二甲基吡啶,于414 nm处比色。D-甘露醇浓度在10～60 mg/L范围内线性良好,R值为0.9992。

蔡友华等[26]进行了SP测定巴西虫草菌丝体中D-甘露醇含量的研究,通过方法可靠性的证明实验表明,D-甘露醇提取液中含有的糖类(包含葡萄糖、鼠李糖和果糖等),只有果糖对检测结果有较大影响,该法适用于不含果糖的巴西虫草菌丝体等的甘露醇含量的测定。因而,SP相较于前述的VA,具有一定的优越性,但仍然受类似糖醇的干扰较大,应用具有一定的局限性。

1.4 高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)

刘薇等[27]以HPLC替代药典中VA测定冬虫夏草菌丝体胶囊(白令胶囊)中D-甘露醇的含量(具体方法参见表1,下同),结果表明传统的VA测定的为样品中具有还原羟基的成分的所有物质,而HPLC测定的是单一的D-甘露醇的含量,结果相对更准确。

表1 各类虫草或其制品中的D-甘露醇HPLC检测方法Table 1 HPLC methods for the determination of D-mannitol in Cordyceps and its products

刘谋盛等[6]在HPLC中,使用了固相萃取预分离技术测定冬虫夏草中D-甘露醇的含量。以水超声振荡浸取冬虫夏草样品中的D-甘露醇,浸取液用Waters Sep-Pak-C18固相萃取小柱预分离,以海藻糖为内标物,Waters Sugar-Pak-1(6.5 mm×300 mm)钙型阳离子交换柱为固定相,0.05 g/L EDTA钙钠水溶液为流动相,以RID检测器测定。在此之前,王琳等[28]对该法进行了尝试,仅以水替代0.05 g/L EDTA钙钠水溶液为流动相。对比两者[6,28]的研究结果表明,该方法中,EDTA钙钠水溶液或水作为流动相效果相当,而EDTA钙钠可减少钙型交换柱材料上钙离子的流失,延长柱的寿命;进行预分离旨在分离除去样品提取液中含有的蛋白质、脂肪等水溶性差的成分,避免其附着在柱材料上不易被流动相洗脱污染柱而降低柱效。

顾振宇等[6,28-29]建立了HPLC-RID测定冬虫夏草及其相关制品中D-甘露醇含量的方法,各方法对D-甘露醇的LOD分布在1.5～2.0 μg/mL。之后,杨昕等[30]建立了HPLC-ELSD测定人工蛹虫草子实体中D-甘露醇含量的方法,对D-甘露醇的LOD为0.1 μg/mL。表1中各方法亦显示,ELSD检测器明显较RID检测器灵敏,对D-甘露醇识别效果更好。因D-甘露醇在紫外区不被吸收,因此紫外检测器不适用;电化学检测器的灵敏度高,对样品选择性好,但对样品前处理的要求较高,操作复杂;RID灵敏度相对较低,对温度和压力的变化较敏感[31]。

王心珉[32]以SP和HPLC法测定人工发酵冬虫夏草菌丝体胶囊D-甘露醇的含量并做比较,结果表明SP测定的D-甘露醇含量为(6.03±0.35)mg/g,显著低于HPLC法的(6.52±0.35)mg/g,差异有统计学意义(p<0.05),但两种方法测定结果呈正相关(r=0.965,p=0.002<0.05);研究结论认为HPLC法的灵敏度、稳定性、准确度、重复性均优于SP,但SP具有操作简单,对试剂的要求较低,不需要特定标准品,经济,快速等优点。

吴敬梅等[33]以蒸馏水超声提取(40 min,360 W)冬虫夏草菌丝体粉末后,以50 ℃水浴继续提取两小时制得提取液,通过HPLC探究冬虫夏草菌丝体中存在的果糖是否会对SP测定D-甘露醇含量产生影响。结果表明,相同浓度的D-甘露醇和果糖的出峰面积大致相同,而样品水提液中的果糖,相对于D-甘露醇,峰面积极其微小,其含量不到D-甘露醇含量的3%,分析得出样品中极其少量的果糖引起的比色法吸光度增量很小,即果糖对D-甘露醇SP测定的干扰极其微小。然而,蔡友华等通过波谱比较和HPLC分析验证了所分析样品(巴西虫草菌丝体)不含有果糖,通过额外加入果糖到样品提取液中(加入后果糖浓度达50 mg/L)测定加入果糖前后吸光度值的变化,发现加入该量果糖后与对照相比吸光度值显著增加(p<0.01)。因为SP测定时使用的KIO4可以把具有羟基的单糖生成醛,由于在酸性条件下游离单糖以稳定的环状结构存在,故不会对测定结果产生干扰,但作为酮糖的果糖在相同的条件下,不能形成稳定的环状结构,可以被KIO4氧化[34]。因而笔者推测,果糖本质上会影响SP测定D-甘露糖醇,但这种影响要基于样品中果糖的量达到一定程度才能呈现出来,这个量是需要进一步研究进行确定。如前所述,蔡友华等与吴敬梅等的研究均表明,HPLC法特异性强,所受干扰少,适合对组成复杂体系中D-甘露醇含量的测定。

由表1可知,目前HPLC中对D-甘露醇的提取主要是使用(热)水与(热)醇浸提、超声或回流提取,对这类方法研究较多。胡秋芬等[35]提出基质固相分散-高效液相色谱法(MSPD-HPLC-ELSD)测定虫草中D-甘露醇的方法。将虫草样品与石墨化碳黑球以质量比为1∶4充分研磨后装柱,用热水洗脱,洗脱液中的D-甘露醇用HPLC测定。基质固相分散技术(Matrix solid-phase dispersion,MSPD)是一种类似于固相提取的样品预处理方法[36],将样品直接与固相萃取材料一起混合研磨,使样品均匀分散于固定相颗粒的表面,形成一个独特的色谱固定相,装柱后依靠所选定的溶剂洗脱样品,具有快速高效、操作简便,且能一次实现提取、净化与分离,现已被广泛应用于食品与植物中成分的提取[37-40]。但在胡秋芬等之后未见有使用该法用于虫草制品中D-甘露醇的提取。

1.5 超高效液相色谱-串联质谱法(Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)

雍太萍等[41]研究了UPLC-MS/MS(超高效液相色谱-串联质谱法)同时测定冬虫夏草制品金水宝胶囊中D-甘露醇等5种成分的含量。用90%的甲醇超声提取(30 min,45 kHz)样品中D-甘露醇,过滤,取滤液以流动相稀释得D-甘露醇待测液。甲醇-0.1%甲酸溶液(5:95,V/V)为流动相,以Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(2.1 mm×150 mm,5 μm)分离,采用电喷雾电离源,多反应离子监测(MRM),m/z为183.1/69,Fragmentor及CE值分别为70、10 V,测得D-甘露醇含量为11051.4 μg/g,回收率为95.33～98.39%,RSD为1.34%。陈志远等[42]以上述同样的方法检测蛹虫草中D-甘露醇等6种成分的含量,测得样品D-甘露醇含量为1421.44 μg/g,回收率为92.1%～102.6%,RSD 3.3%。两者均表明该法样品前处理简单,适合一次多成分分析,且速度快、灵敏度高、抗干扰性强。

1.6 离子色谱法(Ion chromatography,IC)

薛俊杰[21]建立了高效阴离子色谱法测定北虫草中D-甘露醇的方法。1 g子实体粉中加入100 mL水热回流提取2 h。对提取液采用CarboPac MAl检测柱(4×250 mm)分离,流动相为480 mmol/L的NaOH,流速0.40 mL/min,上样量25 μL,柱温30 ℃。后续上样量25 μL,流速0.45 mL/min。将该方法测得结果与HPLC比较表明,两者无显著差异,通过方法学研究发现,两种方法重复性好、精密度高及重现性佳,回收率在95%～105%之间,均适用于北虫草中D-甘露醇含量的测定。相较于HPLC,离子色谱法前处理更简便易行,且可将阿糖醇、海藻糖等与D-甘露醇有效分离[21]。随后,出台了离子色谱-电化学检测器法测定食用菌中包含D-甘露醇等多种成分的测定行业标准[43]。

1.7 气相色谱-质谱联用法(Gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)

GC-MS灵敏度高、效能好,因而被广泛用于检测分析,但用于D-甘露醇的分析报道很少,目前仅用于冬虫夏草、蛹虫草[44-45]中D-甘露醇的检测[46]。

王波等[44]用GC-MS检测蛹虫草中D-甘露醇的含量。以无水吡啶、醋酐热提取蛹虫草中的D-甘露醇,在HP-5MS 5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷毛细管柱上分离,N2为载气,四极杆质谱电子电离源检测。该方法对D-甘露醇LOD为0.173 μg/mL,回收率为101.45%,RSD为2.62%。王和兴等[47]用RO水超声提取D-甘露醇,采用乙酸酐将D-甘露醇衍生化为D-甘露醇六乙酯,用毛细管色谱柱分离,FID检测器检测,建立了保健食品中D-甘露醇的毛细管气相色谱分析方法,实现了葡萄糖、肌醇和山梨醇与D-甘露醇的分离,排除了它们对D-甘露醇测定的干扰。

GUAN Jia等[45]通过梯度式加压溶剂萃取(pressurized liquid extraction,PLE),GC-MS对来自不同区域的13个天然与人工栽培虫草样品的成分进行定性与定量分析。以样品与硅藻土等量混合,加入70%乙醇,在100 ℃、1.034×104kPa下萃取D-甘露醇;离子源ESI,在HP-5MS 5%苯基甲基硅氧烷毛细管柱(30 m×0.25 mm,i.d.)上分离;升温程序:175 ℃维持7 min,然后5 ℃/min升至185 ℃维持5 min,随后4 ℃/min升至230 ℃;分流比1∶50,以高纯氮作载气。MS为EI模式,扫描范围40～550 amu,ie为70 eV,进样口温度250 ℃,离子源温度280 ℃。该方法测定D-甘露醇LOD为0.12 μg/mL,回收率92.2%,RSD 4.6%,通过聚类分析方法建立了基于糖类成分组成与含量的虫草的鉴别方法及品质评估方法。

GC在精密度与准确度上均能达到食品分析的要求,但D-甘露醇的结构决定其极性较大,气化温度高,因而使用GC测定时需要进行衍生化降低沸点,致使其前处理略复杂[21,44,47]。

2 问题与展望

综上所述,目前对虫草及其制品中D-甘露醇的检测技术有VA、SP、HPLC、TLC、GC、HPLC-MS、IC。VA与SP具有操作简便,所需仪器设备简单等优点,因而是沿用多年的传统方法,但存在抗类似官能团或类似结构物质的干扰性差,前处理显色步骤复杂,测定结果不精确等缺陷[7,21]。TLC对操作要求较高,GC前处理复杂等而使这两种方法被应用较少。HPLC、HPLC-MS、IC为近年来的新型检测技术,具有灵敏度高,结果精确,重现性高等优点,HPLC-MS与HPLC相比,抗干扰性更强,灵敏度更高,操作更简便;IC也相对较优,但IC所需设备昂贵,目前普及性不广,可加强推广。

现有对D-甘露醇的检测技术的研究主要集中在提取工艺与监测手段上,即如何进行简便有效的样品处理与精准检测的问题。但研究的深入性还不够,如前所述,在2008年胡秋芬等[35]之后未见有使用MSPD用于虫草及其制品中D-甘露醇的提取,但MSPD浓缩了传统的样品均化、组织细胞裂解、提取、过滤、净化等过程,使样品的预处理变得简便,同时也避免了目标物的损失。因此,MSPD相较于传统的水提与醇提具有明显的优势。王志兵等[37]首次将MSPD与HPLC相结合用于野生冬虫夏草、深层发酵培养的蛹虫草菌丝体和固态培养的蛹虫草子实体中核苷类物质的测定,并对影响基质固相分散的提取条件(分散剂的种类和样品与分散剂的质量、淋洗剂与洗脱剂的种类和体积、净化剂的影响等)进行了优化,最终测定结果令人满意,其结论表明MSPD-HPLC法可被广泛应用于虫草与其相关制品中核苷和碱基的测定。因而,笔者认为可以继续开展MSPD用于虫草及其制品中D-甘露醇的提取分离测定的研究,诸如MSPD对虫草及其制品中D-甘露醇提取条件优化等。同时,提取工艺除简单易操作之外,还应考虑降低或除去干扰物质。D-甘露醇具有易溶于水,微溶于醇的特性,因而综述文献中有一些研究者使用甲醇或甲醇-水体系作为提取液提取D-甘露醇,但有研究发现,甲醇会增加其他类型物质的溶出,增大分析时的背景干扰[48];特定制品的HPLC流动相的比例等需要进一步摸索等。再者,研究的系统性不足,将分析样品对仪器的损伤降到最低也应当是一个考虑的因素,如有研究表明HPLC中,LSID较RID检测器灵敏[30],但HPLC-ELSD测定D-甘露醇时,由于检测样品中的糖类成分在高温下会焦化而污染漂移管,使ELSD检测器产生故障,对仪器不利[21,27]。

对成分复杂的或者伪劣假冒虫草制品的定性定量研究还需广泛开展,如李展平等[10]用飞行时间二次离子质谱(TOF-SIMS)对正品、仿制与伪劣虫草制品进行分析,以质谱峰的m/z位置及峰面积对D-甘露醇进行定性定量,准确有效。同时,可探索基于多种复合型检测技术对D-甘露醇定性的定量分析,如HPLC-Q-TOF-MS/MS[49]。由于新型栽培方法与食品加工工艺的多样性造成人工栽培虫草与虫草制品成分复杂,仅建立一种广适性的方法测定虫草及其制品中D-甘露醇的含量难以可行,因而考虑要形成虫草及相关制品细分产品如医药制品、保健功能食品及其他制品等的特定的行之有效的方法尤为必要。