王 晓 张博闻,2# 和祯泉 赵 奇, 顾金海 何仲义 牛建国,△

(1 宁夏医科大学宁夏颅脑疾病重点实验室; 2 宁夏人民医院手足和重建显微外科; 3 宁夏医科大学基础医学院人体解剖学与组织胚胎学系, 银川 750004)

1998年2个不同的实验组发现了orexin[1-2]。大鼠脑内orexin神经元主要位于下丘脑的背内侧核(dorsomedial nucleus, DMH)、穹窿周围区(perifornical area, PF)以及外侧区(lateral hypothalamus, LH)[3]。Orexin神经元接收多个脑区的传入纤维,其轴突也广泛投射到脑和脊髓[4-5]。Orexin神经元被证明除了参与睡眠-觉醒的调节外,还与摄食行为、能量平衡、奖赏行为及内脏活动等有关[6-8]。中脑水管周围灰质(periaqueductal gray, PAG)是由一群排列紧密的神经细胞围绕中脑水管构成的纵形柱状结构,Beitz等[9]在生理和神经化学的基础上将PAG分为背内侧区(dorsomedial division, dm)、背外侧区(dorsolateral division, dl)、外侧区(lateral division, l)和腹外侧区(ventrolateral division, vl)。PAG参与疼痛的上行传导和下行调控、发声的形成、恐惧及焦虑的产生、复杂的防御反应、奖赏寻求等多种生理功能[10]。电刺激PAG可诱导下丘脑内表达FOS蛋白的神经元数量增多[11]。本实验采用逆行、顺行神经束路示踪技术与免疫组织化学相结合,观察PAG各分区投射到下丘脑的神经纤维分布特点及其与orexin阳性神经元的联系,为PAG各分区的神经元影响orexin阳性神经元的功能提供形态学依据。

1 材料和方法

1.1 动物

雄性SD大鼠50只,体质量280～310g,由宁夏医科大学实验动物中心提供。

1.2 主要仪器和试剂

大鼠脑立体定位仪(RWD, China);光学显微镜(Nikon, Japan);冰冻切片机(Thermo, USA);兔抗orexin、山羊抗兔IgG/Bio(Phoenix Pharmaceuticals Inc);Elite ABC Kit(Vector labs, Pk-6100);CTb、山羊抗CTb(List Biol Labs);驴抗山羊IgG/Bio(Santa Cruz Biotechnology);微量注射器(WPI);BDA(Molecular Probes)。

1.3 CTb逆行示踪实验

大鼠经腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,借助脑立体定位仪,用接有玻璃针的微量注射器向下丘脑穹窿上区或外侧区(以Bregma作为坐标0点： 向后2.9mm,向外侧1.2mm,向下8.5mm;或向后2.9mm,向外侧2.0mm,向下8.5mm)缓慢注射0.1μl的0.5% CTb。术后动物存活5～7d,再次麻醉,暴露心,用500ml的生理盐水快速冲洗血液后,400ml新鲜多聚甲醛固定液持续滴入固定。取脑,多聚甲醛后固定4～6h,蔗糖脱水,连续冰冻切片,片厚40μm,分2组收集,一组用于CTb免疫组织化学显色,主要步骤： 室温下用含2%驴血清的PBS封闭1h;山羊抗CTb(1∶1000)室温过夜;Biotin标记的驴抗山羊 IgG(1∶200)室温3h;ABC(1∶100)室温1h;DAB反应液内显色。另一组切片进行Nissal染色,用于辅助识别核团轮廓。

1.4 BDA顺行示踪与orexin免疫组织化学显色相结合实验

大鼠麻醉后,立体定位仪下分别向PAG分区dlPAG(Bregma： 向后7.2mm,向外侧0.9mm,向下5.0mm),lPAG(Bregma： 向后7.2mm,向外侧1.0mm,向下5.6mm),vlPAG(Bregma： 向后7.2mm,向外侧0.9mm,向下6.0mm)内注射约0.02μl 10% BDA。大鼠存活5～7d后,灌注取脑切片,片厚40μm,分4组收集切片,分别用于单独显色BDA,单独显色orexin,双标显色BDA和orexin以及Nissal染色。双标显色BDA和orexin的主要步骤： 0.2% Triton X-100 PBS室温3h;ABC(1∶100)室温1h;含0.06%硫酸镍铵的DAB液将BDA标记的神经纤维染为黑色;用含2%山羊血清的PBS封闭1h;兔抗orexin(1∶2000)室温过夜;Biotin标记的羊抗兔IgG室温3h;ABC(1∶100)室温1h;DAB反应液内显色,orexin免疫组织化学阳性细胞显示为棕色。显微镜观察照相后,通过Adobe Illustrator CS6对BDA标记的神经纤维和orexin阳性神经元胞体在下丘脑的分布进行绘图。借助Nissal染色描绘下丘脑及PAG的核团界限。

2 结果

2.1 下丘脑内orexin阳性神经元胞体的分布

本实验orexin免疫组织化学阳性神经元胞体主要分布在下丘脑DMH、PF和LH(图1A、B),与以往研究结果一致[3,12]。可见orexin神经元胞体在DMH外侧、穹窿(fornix, f)与未定带(Zona incerta, ZI)之间的区域形成密集分布,本研究中将此区域称作“穹窿上区”(图1B)

2.2 PAG各分区向下丘脑orexin阳性神经元胞体分布区域投射神经元的观察

将逆行示踪剂CTb注射到20只大鼠的下丘脑,其中5只大鼠的CTb注射区局限在orexin阳性神经元胞体分布最密集的穹窿上区(图1C),4只大鼠的CTb注射区位于LH(图1D)。2种CTb注射区的大鼠,均在PAG内可见大量CTb逆行标记的神经元,分布特点相似(图1E～H)。注射点同侧PAG内的CTb标记神经元胞体的数量明显多于对侧。同侧的lPAG和vlPAG中,可见大量CTb标记神经元;dlPAG及dmPAG中见少量标记神经元。对侧的vlPAG中可见少量的CTb神经元。另外,在背侧中缝核也可见CTb标记的神经元。

图1 A和B分别为分布于大鼠下丘脑冠状切面orexin阳性神经元在低倍(A)或高倍(B,由图A中方框b区域放大)镜下观察所见;C和D分别为位于下丘脑穹窿上区(C)和下丘脑外侧区(D)的CTb注射点(棕染区域);E和F为CTb注射到下丘脑穹窿上区(图C所示)后,PAG内CTb标记神经元胞体在低倍(E)或高倍(F,图E中方框f区域的放大)镜下观察所见,图E中每一个红色圆圈代表一个CTb标记神经元胞体);G和H为CTb注射到下丘脑外侧区(图D所示)后,PAG内CTb标记神经元胞体在低倍(G)或高倍(H,图G中方框h区域的放大)镜下观察所见,图G中每一个红色圆圈代表一个CTb标记神经元胞体);I-L为BDA注射到PAG背外侧区(I)后,下丘脑内BDA标记的神经纤维和orexin阳性神经元在低倍(J)和高倍(K和L,分别放大于图J中方框k和l区域)镜下观察所见;M-P为BDA注射到PAG外侧区(M)后,下丘脑内BDA标记的神经纤维和orexin阳性神经元在低倍(N)和高倍(O和P,分别放大于图N中方框o和p区域)镜下观察所见;Q-T为BDA注射到PAG腹外侧区(Q)后,下丘脑内BDA标记的神经纤维和orexin阳性神经元在低倍(R)和高倍(S和T,分别放大于图R中方框s和t区域)镜下观察所见;箭头所示为BDA标记的轴突终末与orexin阳性神经元表面紧密接触(K,O,P,S和T)。标尺=500μm(A，C,D，E，G，I，M和Q)，标尺=100μm(J,N和R)，标尺=50μm(B)，标尺=20μm(F，H，K，L，O，P，S和T).

Fig 1 Photomicrographs showed： orexin-immunoreactive (ir) neurons (brown-colored) were distributed in the hypothalamus of rats at a low (A) or high (B, enlarged from area enclosed by the small rectangle (b) in A) magnification; the sites of CTb injection into the suprafornical area of hypothalamus (C) and lateral hypothalamus (D) respectively; distribution of CTb-labeled cell bodies in the PAG at low (E) or high (F, enlarged from area enclosed by the small rectangle (f) in E) magnification after CTb injection into the suprafornical area of hypothalamus (showed in C), each open circle represented one cell body; distribution of CTb-labeled cell bodies in the PAG at low (G) or high (H, enlarged from area enclosed by the small rectangle (h) in G) magnification after CTb injection into the lateral hypothalamus (showed in D), each open circle represented one cell body; I-L, the site of BDA injection into the dorsolateral PAG (I), and resulting overlapping existence of BDA-labeled fibers (black-colored) and orexin-ir neurons (brown-colored) in the suprafornical area of the hypothalamus at a low (J) or high (K and L, enlarged from areas enclosed by the small rectangle (k) and (l) in (J), respectively) magnification; the site of BDA injection into the lateral PAG (M), and resulting overlapping existence of BDA-labeled fibers (black-colored) and orexin-ir neurons (brown-colored) in the suprafornical area of the hypothalamus at a low (N) or high (O and P, enlarged from areas enclosed by the small rectangle (o) and (p) in (J), respectively) magnification; the site of BDA injection into the ventrolateral PAG (Q), and resulting overlapping existence of BDA-labeled fibers (black-colored) and orexin-ir neurons (brown-colored) in the suprafornical area of the hypothalamus at a low (R) or high (S and T, enlarged from areas enclosed by the small rectangle (s) and (t) in (R), respectively) magnification; BDA-labeled boutons (arrowheads) were in contiguity with the orexin-ir neurons (K, O, P, S and T). Scale bar=500 μm (A, C, D, E, G, I, M and Q), 100 μm (J, N and R), 50 μm (B), 20 μm (F, H, K, L, O, P, S and T).

2.3 PAG各分区向下丘脑orexin阳性神经元胞体分布区投射纤维的分布及它们之间的联系

2.3.1 dlPAG来源的投射纤维在下丘脑中的分布 将顺行示踪剂BDA注射到dlPAG的10只大鼠中,4只大鼠获得了位置准确且剂量适中的注射点(图1I)。包含下丘脑的切片进行BDA与orexin双标显色之后可见,双侧下丘脑内均可观察到BDA顺标纤维,注射点同侧的下丘脑内标记的纤维数量多于对侧。结果显示,dlPAG来源的纤维在ZI以及ZI与DMH之间的区域形成了较高密度分布(图1J,图2)。在下丘脑前区(anterior hypothalamic area, AH)和下丘脑后区(posterior hypothalamic nucleus, PH)可观察到高密度分布的标记纤维(图2A、E、F)。

下丘脑内BDA标记纤维与orexin阳性神经元在穹窿上区形成重叠分布(图2B～E),但少见BDA标记的轴突终末与orexin阳性神经元存在密切接触(图1J～L)。

2.3.2 lPAG来源的投射纤维在下丘脑中的分布 将BDA注射到lPAG的10只大鼠中,有5只大鼠获得了位置准确且剂量适中的注射点(图1M)。包含下丘脑的切片进行BDA与orexin双标显色之后,双侧下丘脑内均可观察到BDA标记的神经纤维,而注射点同侧下丘脑内标记的神经纤维数量具有绝对优势。可见BDA顺行标记的神经纤维大量出现在orexin阳性神经元胞体分布的区域,尤其是在穹窿上区、IZ以及DMH与ZI之间的区域形成了非常致密的分布(图1N,图3B～E)。在AH和PH均观察到高密度BDA标记纤维(图3A、E、F),下丘脑的其他区域也可见密度不等的标记纤维。

BDA标记的神经纤维和orexin阳性神经元在穹窿上区形成了明显的重叠分布,可见orexin神经元分布在BDA标记神经轴突形成的网络中(图1N～P,图3),常见BDA标记轴突终末紧贴orexin神经元胞体或树突的表面(图1O、P)。另外,在LH,orexin神经元与BDA标记的神经纤维形成了相对疏松的重叠(图3),部分orexin神经元胞体或树突与BDA标记轴突终末形成接触。

图2 中脑水管周围灰质背外侧区(dlPAG)来源的BDA标记的神经纤维(细线)和轴突终末(小点)与orexin阳性神经元胞体(大点)的重叠分布。A-F显示由前到后排列的下丘脑冠状切面，图中一个大点代表约三个orexin神经元胞体。底部的数字为此切面位于bregma后的距离(mm).

Fig 2 The overlapping distribution of BDA-labeled fibers (fine lines) and terminals (fine dots), and orexin-immunoreactive cell bodies (filled circles) after BDA injection into the dorsolateral PAG and immunostaining of orexin. Line drawings of frontal sections arranged rostrocaudally (A-F) through the hypothalamus. Three cell bodies were substituted by one filled circle. The distance (mm) behind bregma was noted at the bottom right in each drawing.

图3 中脑水管周围灰质外侧区(lPAG)来源的BDA标记的神经纤维(细线)和轴突终末(小点)与orexin阳性神经元胞体(大点)的重叠分布。A-F显示由前到后排列的下丘脑冠状切面中,图中一个大点代表约三个orexin神经元胞体。底部的数字为此切面位于bregma后的距离(mm).

Fig 3 The overlapping distribution of BDA-labeled fibers (fine lines) and terminals (fine dots), and orexin-immunoreactive cell bodies (filled circles) after BDA injection into the lateral PAG and immunostaining of orexin. Line drawings of frontal sections arranged rostrocaudally (A-F) through the hypothalamus. Three cell bodies were substituted by one filled circle. The distance (mm) behind bregma was noted at the bottom right in each drawing.

2.3.3 vlPAG来源的投射纤维在下丘脑中的分布 将BDA注射到vlPAG的10只大鼠中,有4只大鼠获得了位置准确,剂量适中的注射点(图1Q)。包含下丘脑的切片进行BDA与orexin双标显色之后,在双侧下丘脑内可观察到BDA标记的神经纤维,注射点同侧的下丘脑内神经纤维数量有绝对优势。可见下丘脑内BDA顺行标记的神经纤维在穹窿上区、DMH上部及ZI与DMH之间的区域形成了非常致密的分布(图4B～D);在DMH与f之间区域形成了高密度的分布,在LH形成中密度分布,在f腹侧有低密度分布。另外,在AH和PH区域可观察到高密度BDA标记纤维(图4A、E、F)。

BDA标记纤维和orexin阳性神经元在穹窿上区形成明显的重叠,orexin阳性神经元分布在BDA标记纤维形成的网络中(图1R～T, 图4B～E),常见BDA标记轴突终末紧贴orexin阳性神经元胞体或树突的表面(图1S、T)。另外,BDA标记的纤维与orexin阳性神经元在LH形成了相对疏松的重叠,少量orexin神经元胞体或树突与BDA标记轴突终末形成接触。

图4 中脑水管周围灰质腹外侧区(vlPAG)来源的BDA标记的神经纤维(细线)和轴突终末(小点)与orexin阳性神经元胞体(大点)的重叠分布。A-F显示由前到后排列的下丘脑冠状切面中,图中一个大点代表约三个orexin神经元胞体。底部的数字为此切面位于bregma后的距离(mm).

Fig 4 The overlapping distribution of BDA-labeled fibers (fine lines) and terminals (fine dots), and orexin-immunoreactive cell bodies (filled circles) after BDA injection into the ventrolateral PAG and immunostaining of orexin. Line drawings of frontal sections arranged rostrocaudally (A-F) through the hypothalamus. Three cell bodies are substituted by one filled circle. The distance (mm) behind bregma was noted at the bottom right in each drawing.

3 讨论

3.1 PAG不同分区投射到下丘脑的神经纤维形成不同的分布模式

早期以PHA-L作为顺行示踪剂的实验观察到dlPAG和vlPAG均有神经纤维投射至同侧下丘脑[13]。Hahn等[14]将CTb注射到下丘脑后,在PAG内观察到逆行标记的神经元,但其CTb注射点的位置不在orexin神经元胞体密集的区域。本课题组之前采用免疫电镜观察到了lPAG来源的神经轴突终末与穹窿周围的orexin神经元形成突触联系[12],但没有观察PAG不同分区对orexin神经元支配的整体情况。本研究将逆行示踪剂CTb注射到orexin神经元胞体分布最密集的穹窿上区或LH后,在PAG不同分区观察到了数量不等的CTb逆行标记神经元;将顺行示踪剂BDA注射到PAG的不同分区后,显示PAG不同分区投射到下丘脑的神经纤维形成不同的分布模式。PAG参与协调诸多行为和生理功能调节[15],PAG到下丘脑orexin神经元的投射可能是其发挥调节作用的形态学基础。

3.2 dlPAG来源的神经纤维少见与orexin阳性神经元形成直接接触

dlPAG被证明可能在防御行为及内脏活动调节过程中发挥重要作用[16-17],但本实验结果表明dlPAG投射到下丘脑orexin区域的神经纤维少见与orexin神经元之间有直接接触,提示dlPAG对orexin神经元功能的直接影响较小。

3.3 lPAG到orexin神经元的投射可能参与调节觉醒、应激以及防御反应

lPAG神经元整合头面部、躯干和四肢的躯体浅感觉。刺激躯体表面时,lPAG内神经元的FOS免疫反应明显增强[18]。将微量兴奋性氨基酸注射到lPAG后,会引起动物心率加快、血压升高、呼吸加速等交感神经兴奋为特征的应激状态,促使动物对外部刺激做出积极防护反应或逃脱[16]。本研究观察到lPAG来源的神经纤维主要在下丘脑穹窿上区与orexin阳性神经元重叠分布并直接接触,此区域内的orexin神经元主要参与觉醒和心肺调节[8,19]。lPAG到orexin神经元的投射可能是其参与调节觉醒、应激以及防御反应的通路。

3.4 vlPAG可能通过传递痛觉影响orexin神经元的功能

vlPAG不仅接受来自脊髓和脑皮质的传入,同时接受来自臂旁核和孤束核的传入,整合躯体深感觉和内脏感觉的传入信息,在痛觉的上行传导和下行调控中发挥重要作用[20]。采用化学遗传学选择性激活vlPAG内谷氨酸能神经元或抑制GABA能神经元能显著抑制痛觉,选择性抑制谷氨酸能神经元或抑制GABA能神经元能促进痛觉[21]。本研究观察到vlPAG投射到下丘脑的纤维在穹窿上区与orexin神经元重叠分布并形成直接接触。这些结果提示vlPAG神经元介导的痛觉信息可能直接影响orexin的功能。

下丘脑LH的orexin神经元与奖赏以及摄食行为有关[8,19]。本实验结果显示源自lPAG和vlPAG神经纤维也投射到LH的orexin阳性神经元,提示lPAG和vlPAG也可能通过影响orexin神经元参与调节奖赏、摄食行为或其他功能。