李莹莹 王琳琳 马琳琳 王 语 肖丹丹 张晓萍 于向民 荆 昭 李 玲

(青岛大学人体解剖学与组织学胚胎学系, 青岛 266071)

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种常见的慢性炎症疾病[1],是多数心血管疾病的病理基础,心血管疾病死亡率上升主要是由于动脉粥样硬化性血管疾病死亡率上升所造成[2]。染料木黄酮是最活跃的天然黄酮类化合物,具有多种生物学作用,包括抗氧化、抗增殖和抗肿瘤功能等[3]。染料木黄酮作为一种非特异性酪氨酸激酶抑制剂,因其在生物医学和生物技术方面对人类某些心血管疾病,尤其是动脉粥样硬化具有潜在的价值,所以备受科研工作者关注[4]。蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)是丝氨酸/苏氨酸激酶,参与细胞增殖、蛋白质合成和细胞凋亡等生理活动,能够促进细胞存活和增殖[5]。目前,染料木黄酮对动脉粥样硬化作用的机制尚不明确。本实验主要探究了染料木黄酮对小鼠动脉粥样硬化的治疗作用及其相关作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

小鼠高脂饲料(0.25%胆固醇+15%脂肪)、普通饲料购买于北京华阜康生物科技股份有限公司;染料木黄酮标准品(Genistein, GST)由大连市美仑生物技术公司提供;饱和油红O染色液(oil red O solution)购于索莱宝公司;鼠源p-Akt单克隆抗体购于Santa Cruz公司;兔源Akt单克隆抗体、兔源β-actin单克隆抗体购于北京博奥森公司。

1.2 动脉粥样硬化小鼠模型的制备

雄性6周龄C57BL6小鼠50只,体质量17～22g,先以普通饲料喂养1周后随机分5组,每组10只： 低浓度染料木黄酮组(左颈总动脉套管+高脂饲料+染料木黄酮5mg·kg-1·d-1)、高浓度染料木黄酮组(左颈总动脉套管+高脂饲料+染料木黄酮20mg·kg-1·d-1)、阿托伐他汀钙组(左颈总动脉套管+高脂饲料+阿托伐他汀钙10mg·kg-1·d-1)及模型组(左颈总动脉套管+高脂饲料+生理盐水)、空白对照组10只(普通饲料+生理盐水)。药品均为灌胃处理,室温19℃～22℃,自然采光,自由饮水,每周测量体质量并记录。

1.3 血液和动脉样本的采集

实验第15周,小鼠经腹腔注射水合氯醛麻醉,股动脉取血,解剖小鼠,取左颈总动脉1.5～2.0cm,浸入4%多聚甲醛固定。

1.4 血脂检测

取血清,送至青岛大学附属医院检验科检测血脂高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血清总胆固醇和甘油三酯含量。

1.5 病理学观察

将4%多聚甲醛固定的小鼠颈总动脉一部分脱水透明后用石蜡包埋,以厚度为5μm连续切片后H-E染色。另一部分4%多聚甲醛固定的颈总动脉用OCT包埋剂包埋后进行连续冰冻切片,厚度约0.6mm,切片后油红O染色。

1.6 蛋白印迹检测p-Akt蛋白表达

高速组织研磨机研磨各小组颈总动脉组织,加入含有 PMSF和磷酸酶抑制剂的高效 RIPA蛋白酶裂解液提取颈总动脉总蛋白,BCA试剂盒测定蛋白浓度。每组上样量为10μg,经过SDS-PAGE凝胶电泳后,采用湿转法恒压1h将蛋白转到PVDF膜上。5%脱脂奶粉置于摇床上封闭1h,洗膜,加入一抗 p-Akt(1∶600)和β-actin(1∶1500),4℃孵育过夜,洗膜,加羊抗鼠二抗(1∶5000)室温孵育1h后,洗膜。PVDF膜上滴入超敏化学发光试剂ECL并反应2min,用VILBER Fusion FX7成像系统调节曝光时间成像。成像后用一抗二抗去除液漂洗 PVDF膜,加入TBST漂洗,再次封闭1h,洗膜,加入一抗 Akt(1∶600),以后步骤同上。各组条带用Image-J分析灰度值。

1.7 免疫荧光检测p-Akt蛋白表达

从-20℃冰箱取出6μm的冻干切片并立刻放入双蒸水中浸泡10min, PBS洗片,后吸干组织周围的水分,使载玻片干燥。将切片放入湿盒,用10%的羊血清溶液在室温下封闭1h。吸干封闭液,用足量的p-Akt一抗溶液完全浸没切片入湿盒4℃过夜。PBS洗片,切片在湿盒中与相应的荧光抗体室温孵育2h。用足够量的荧光二抗(1∶250)溶液完全浸没切片。PBS洗片,将切片孵育核染DAPI约15min。PBS洗片,切片干后,滴加少许抗荧光淬灭剂,缓慢盖上盖玻片。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 体质量变化

5组小鼠体质量在手术后1～2周略有下降,3～8 周体质量增长较快,此后体质量呈缓慢增长。实验期间各组间小鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。

图1 5组小鼠体质量变化

2.2 血脂检测

空白对照组,高、低浓度染料木黄酮,阿托伐他汀钙组与模型组之间血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)含量差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，染料木黄酮对于血清中总胆固醇含量无明显影响(P>0.05),低浓度染料木黄酮组对于血清中低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的影响不明显(P>0.05)。

2.3 H-E染色组织形态学

连续石蜡切片后H-E染色,通过光学显微镜观察并记录小鼠颈总动脉套管侧组织学变化(图2)。颈总动脉空白对照组(图2A1)内膜光滑,血管管壁薄,管腔内无明显变化,模型组(图2E1)内膜有斑块形成,血管管壁略厚。阿托伐他汀钙对照组(图2B1),低、高浓度染料木黄酮组(图2C1、D1)相比无明显区别。

表1 各组小鼠血脂变化结果(n=10,±s, mmol/L)

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsmodel group

2.4 油红O染色组织形态学

连续冰冻切片油红O染色,通过光学显微镜观察并记录小鼠颈总动脉套管侧脂滴含量变化。空白对照组(图2A2)、阿托伐他汀钙组(图2B2)、高浓度染料木黄酮组(图2D2)组织内无明显脂滴,低浓度染料木黄酮组(图2C2)组织内含有少量脂滴,模型组(图2E2)颈总动脉组织内脂滴含量相对较高。

2.5 免疫印迹检测增殖相关蛋白Akt表达情况

对免疫印迹图像(图3)灰度值分析显示(图4),低、高浓度染料木黄酮组的蛋白表达量与空白对照组相比,高浓度染料木黄酮组与空白对照组相似,低浓度染料木黄酮组蛋白表达量明显高于空白对照组(P<0.01)。低浓度染料木黄酮组p-Akt蛋白表达量明显高于阿托伐他汀钙组(P<0.01)。高浓度染料木黄酮组p-Akt蛋白表达量明显低于模型组,低浓度染料木黄酮组 p-Akt蛋白表达量低于模型组(P<0.01)。据此推断,高浓度染料木黄酮组对于小鼠动脉粥样硬化有明显的治疗效果。

图3 免疫印迹检测p-Akt蛋白含量的表达

2.6 免疫荧光检测增殖相关蛋白Akt的表达

实验结果(图4、5)表明,免疫荧光检测p-Akt表达变化趋势与免疫印迹检测结果基本一致。即高、低浓度染料木黄酮组和模型组相比较,p-Akt在高浓度染料木黄酮组的小鼠血管细胞表达数明显降低(P<0.05)。高、低浓度染料木黄酮组和空白对照组、阿托伐他汀钙组相比较,p-Akt在低度染料木黄酮组的小鼠血管细胞表达数明显增多(P<0.05)。高浓度染料木黄酮组可有效抑制p-Akt的表达,对于小鼠动脉粥样硬化有明显的治疗效果。

图5 p-Akt蛋白表达在各组小鼠颈总动脉中的变化

3 讨论

动脉粥样硬化是对人类的健康影响最严重、最常见的慢性病之一[6]。同时,动脉粥样硬化还是心脑血管疾病的病理基础,全球每年大约2000万人死于动脉粥样硬化的相关疾病[7]。

颈总动脉内置鞘管法可改变血流动力学,使血管壁的剪切力发生一定的改变[8],是构建小鼠动脉粥样硬化动物模型的一种造模方法[9]。

动脉粥样硬化斑块的产生学说之一是血管平滑肌细胞的异常增殖以及脂质的过氧化损伤。动脉粥样硬化的病变闭塞是由于动脉内膜厚度的增加,而其厚度增加是由于血管平滑肌细胞的大量增加,这些血管平滑肌细胞能够形成新的结缔组织,从而导致高血脂症个体的细胞内和细胞外脂质积累。血管平滑肌细胞的异常增殖在动脉粥样硬化的发生中起至关重要的作用。在细胞凋亡、细胞存活和细胞增殖等过程中,Akt信号通路都发挥着关键的作用。此外,Akt 信号通路介导的级联反应也是非常重要的免疫反应通路,能够调节炎症因子分泌[10]。在动脉粥样硬化的发生发展过程中,氧化应激、氧化低密度脂蛋白及炎症因子导致p-Akt 迅速失活,凋亡相关基因的表达升高,进而导致血管内皮细胞凋亡;此外,血管平滑肌的迁移、增殖表型转换以及泡沫细胞的形成等都和磷酸化Akt的活性相关联[11]。Akt的表达在动脉粥样硬化 的发生和发展进程中起着十分重要的作用[11],通过抑制Akt信号通路,可延缓动脉粥样硬化的形成及发展。

尽管动脉粥样硬化发生在血管内壁,但没有直接针对血管壁进行预防的临床药物。动脉粥样硬化形成的过程中,需要新的靶分子提供治疗靶点。目前,他汀类药物是临床上常用的降脂药物,具有多种药理作用,可以降低心血管疾病的风险[12-14]。诺华生物医学研究院认为： 尽管他汀类药物在治疗动脉粥样硬化方面疗效显著,但仍有一部分患者的病情继续恶化。因此,寻找其他类别或能够辅助抑制动脉粥样硬化的新型临床药物是有必要的。

相对男性而言,女性心血管疾病死亡率较低,其中部分原因是由于女性雌激素表达水平较高。许多研究表明雌激素具有多种生物学效应,能够减轻动脉粥样硬化[15]。染料木黄酮是存在于大豆异黄酮中的重要活性元素,是大豆异黄酮产品中的主要功能成分,属于植物雌激素的一种,在结构上与17β-雌二醇类似,植物雌激素具有抗动脉粥样硬化的作用[16]。目前,染料木黄酮对于动脉粥样硬化的治疗作用研究较少,且作用的机制尚不明确。本实验主要探究了染料木黄酮对于小鼠动脉粥样硬化的治疗作用及相关作用机制。

研究表明阿托伐他汀钙[17]和染料木黄酮[18]能够调节脂质代谢。本实验选取阿托伐他汀钙作为阳性对照组,同样证明模型组及他汀组血总胆固醇、甘油三酯及低浓度脂蛋白水平高于对照组,而他汀组血脂水平低于模型组。低、高浓度染料木黄酮组中总胆固醇含量均没有明显变化;高浓度染料木黄酮组的高密度脂蛋白含量要高于模型组,效果和阿托伐他汀钙组相近,但低浓度染料木黄酮组没有明显效果。本研究证明,高浓度染料木黄酮干预组可以有效降低甘油三酯,低密度脂蛋白的含量,同时提高高密度脂蛋白在血清中的含量,且治疗效果与阿托伐他汀钙组(10mg·kg-1·d-1)相近。

染料木黄酮可以抑制血管炎症,主要是通过抑制核转录因子-B(nuclear factor kappa B, NF-κB)[19]、核因子E2相关因子2/血红素氧合酶-1 (nuclear factor-E2-related factor 2/heme oxygenase-1, Nrf2/HO-1)[20]、磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)[15]和细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2)[21]信号通路实现的。阿托伐他汀钙药物治疗动脉粥样硬化可以减少斑块的形成[22],研究表明此类药物对平滑肌细胞的增殖也起到了明显的抑制作用[23],其可能机制是抑制 p-Akt的活性。血管平滑肌细胞的增殖和迁移是动脉粥样硬化引起血管损伤和再狭窄的一个原因。在动脉粥样硬化发展之初血管平滑肌细胞从收缩型变成分泌型,并迁移到血管内膜从而导致内膜的增生[15,23]。平滑肌细胞的异常增殖和Akt信号通路关系密切,笔者推测染料木黄酮可在体内通过抑制p-Akt,进而对动脉粥样硬化起治疗作用。本研究选取阿托伐他汀钙作为阳性对照组,比较不同浓度的染料木黄酮的体外药用效果。本研究通过比较不同剂量的染料木黄酮在小鼠体内的药用效果显示,Akt信号通路在小鼠动脉粥样硬化的形成和发展的过程中发挥着重要的调节作用,高浓度染料木黄酮可以有效地抑制p-Akt的表达,其抑制效果和阿托伐他汀钙的小鼠体内药用效果相近。

综上所述,染料木黄酮在小鼠体内通过降低血脂水平,下调p-Akt的表达,减少血管内斑块的形成,发挥一定的抗动脉粥样硬化的作用。染料木黄酮在防治动脉粥样硬化中具有重要的潜在临床药用价值。