高赛红 张小良 杨迎春 任占川

(山西医科大学汾阳学院, 汾阳 032200)

脑缺血再灌注损伤威胁患者生命并影响其生活质量,如何减轻再灌注损伤,成为目前研究热点之一。国内外研究[1-2]表明,p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase, p38MAPK)信号通路与脑缺血再灌注损伤有着非常紧密的关系,几乎参与了缺血性脑损伤的全部病理生理过程。同时p38MAPK信号通路也是参与血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)破坏的关键途径[3]。基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)参与脑缺血再灌注损伤中BBB的破坏,主要表现为降解Ⅳ型胶原破坏基底膜[4]。李国辉等[5]报道在脑缺血再灌注损伤过程中阻断p38MAPK通路的过激活,可下调MMP-9的高表达,减轻血脑屏障破坏。此外,本课题组前期研究结果[6-7]表明p38MAPK和MMP-9均参与高脂血症加重脑缺血再灌注损伤,但在高脂血症加重再灌注损伤过程中,抑制p38MAPK表达活化是否能明显抑制MMP-9表达尚未可知。本实验采用神经行为学评分、TTC染色、EB染色、免疫印迹和反转录PCR等方法,观察高脂血症脑缺血再灌注损伤中p38MAPK和MMP-9表达变化,检测p38MAPK抑制剂SB203580对p38MAPK和MMP-9表达的影响,探究高脂血症脑缺血再灌注损伤中p38MAPK是否可影响MMP-9表达,为明确高脂血症加重脑缺血再灌注损伤机制提供新依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂、仪器

胆固醇、猪胆盐(北京奥博星);TTC粉剂(1g索莱宝分装amresco);甲酰胺(索莱宝分装amresco),EB伊文思蓝(索莱宝分装Sigma);p38MAPK一抗和MMP-9一抗(Bioworld);哺乳动物组织总蛋白提取试剂、HRP-羊抗兔、ECL超敏感发光剂(武汉博士德);TRIzol(北京天根生化);PCR引物(上海生工);PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit和Premix Taq TM Hot Start Version(TaKaRa);高速冷冻离心机(GL-20G-Ⅱ 上海);微孔板分光光度计(BioTek 美国);电泳仪、湿性转膜仪(北京六一仪器);凝胶成像与分析系统(JD-801江苏捷达)。

1.2 动物分组

山西医科大学动物实验中心提供的清洁级雄性SD大鼠,质量180g±20g。喂食高脂饲料,高脂血症动物模型成功后,36只高脂血症大鼠随机分为4组,抑制剂SB203580预处理的脑缺血2h再灌注24h组(SB组),DMSO预处理的脑缺血2h再灌注24h组(DMSO组),SB203580预处理的假手术组(sham+SB组)及DMSO预处理的假手术组(sham+DMSO组),每组9只。3只用于TTC染色检测梗死灶体积,3只用于EB染色检测血脑屏障通透性,3只用免疫印迹和RT-PCR检测p38MAPK、MMP-9表达量及MMP-9 mRNA水平。造模前30min,按5mg/kg(5mg SB203580溶于1ml DMSO中)剂量腹腔注射SB203580[8];DMSO按1ml/kg剂量腹腔注射。

1.3 模型建立

猪油10%、胆固醇3%、蛋黄粉2.5%、猪胆盐0.5%、基础饲料84%配制高脂饲料[9]。大鼠在同一环境下自由进食饮水,6周后检测血脂。高脂血症模型建立成功后,参照Zea-Longa[10]线栓法,采用直径0.26mm的天丝太极鱼线,头端蘸蜡使其变得圆钝,直径约0.28mm,从左侧颈总动脉插入,经颈内动脉到达大脑中动脉,遇到阻力即停,插入长度18～20mm。2h后将鱼线退出约10mm,恢复血液供应,再灌注24h,建立局灶性脑缺血再灌注模型。

1.4 神经行为学评分

参照Zea-Longa 5分制法[10]对各组大鼠进行神经行为学评分。0分： 正常,无神经损伤症状;1分： 右侧前爪部分屈曲或全部屈曲;2分： 行走时向右侧偏瘫转圈;3分： 行走时向右侧倾倒;4分： 不能自发行走,意识丧失。将0分及4分的动物模型剔除。

1.5 TTC染色检测梗死灶体积

称取2 g TTC粉剂溶于100ml 1×PBS(pH 7.2～7.4)溶液中,配成2%工作液。再灌注24h时将大鼠深麻后迅速断头取脑,放于培养皿中-20℃冻存15min,取出后去除嗅球、小脑及脑干,从前向后做2mm厚连续冠状切片,放于6孔培养板中,加入适量2% TTC染液,包裹锡纸避光,放入37℃孵箱中作用30min,每隔5min晃动培养板1次,使其染色充分。染色结束后移液器吸出染液,然后加入10%多聚甲醛固定液固定24h[11]。拍照,病理图像处理系统分析。

1.6 伊文思蓝(Evans blue, EB)染色检测血脑屏障通透性

再灌注结束前2h股静脉注射2% EB染液0.3ml/100g[12],2h后将大鼠深麻迅速断头取脑,分离左侧大脑半球称湿重后放入3ml甲酰胺溶液中,将其放于60℃ 恒温水浴锅中24h。5000r/min离心20min取上清液,然后10000r/min再次离心10min取上清液。波长632nm检测上清液吸光度,据标准曲线方程计算样本的伊文思蓝浓度,进而求出样本伊文思蓝的含量,用伊文思蓝含量与左侧大脑半球湿重的比值表示血脑屏障通透性。

1.7 免疫印迹检测p38MAPK和MMP-9表达水平

提取组织总蛋白,BCA微孔板法测定组织提取液蛋白浓度。垂直凝胶电泳60V恒压沉积,120V恒压分离蛋白,80V恒压转膜80min,转膜结束后1×TBST洗膜3次,每次10min。p38MAPK条带用5%脱脂奶粉封闭2h,加1∶800比例稀释的兔抗鼠p38一抗,4℃过夜。MMP-9条带用8%脱脂奶粉封闭2.5h,加1∶4000比例稀释的兔抗鼠MMP-9一抗,4℃过夜。1∶4000稀释的羊抗兔二抗室温作用30min后37℃反应1h,ECL超敏感发光剂暗室曝光显示蛋白条带。凝胶成像与分析系统采集图像并检测蛋白条带灰度值。

1.8 反转录PCR检测MMP-9 mRNA

取适量缺血侧大脑皮质,逐步加入TRIzol、氯仿、异丙醇提取RNA,用RNase-free ddH2O配制的75%乙醇洗涤RNA白色沉淀物两次,放置2～3min后加入50μl RNase-free ddH2O溶解,酶标仪检测RNA溶液浓度。按TaKaRa公司的PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒操作,获得cDNA溶液。内参β-actin引物,Forward： 5′-CACCCGCGAGTACA ACCTTC-3′; Reverse： 5′-CCCATACCCACCATCA CACC-3′。MMP-9引物,Forward： 5′-AACTCGGCA GGAGAGATGTG-3′;Reverse： 5′-GGTCAGGTTTA GAGCCACGA-3′。配制PCR反应液50μl混匀后,94℃预变性1min,94℃变性30s,60.5℃退火30s,72℃延伸30s,如此变性、退火、延伸循环30次后,72℃延伸10min,4℃保持。MMP-9 cDNA扩增产物长度为331bp,内参cDNA扩增产物长度为207bp,扩增产物-80℃保存。取适量扩增产物与6×上样缓冲液混匀后,琼脂糖凝胶电泳90V恒压跑胶,捷达凝胶图像采集分析系统处理。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠神经行为改变

Sham+DMSO组大鼠和sham+SB组大鼠均未见异常表现,神经行为学评分为0分。DMSO组大鼠和SB组大鼠均表现出不同程度的神经行为损伤症状。DMSO组大鼠主要表现为向右侧倾倒或转圈,神经行为学评分为2.87±0.39分。SB组大鼠大部分表现为右侧前爪部分屈曲,小部分表现为向右侧转圈,神经行为学评分为1.59±0.26分。与DMSO组比较,SB组评分明显降低(P<0.05)。

2.2 各组脑梗死灶体积

脑组织冠状切片TTC染色后,正常组织呈现红色,而缺血梗死区为白色。两假手术组脑组织均匀红染,未见梗死区,而SB组和DMSO组均可见不同范围的白色梗死灶,与相应假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)。DMSO组大鼠脑梗死灶体积百分比为32.09±0.35,而SB组大鼠脑梗死灶体积百分比为14.37±0.31,与DMSO组比较明显减小(P<0.05)(图1)。

图1 各组脑梗死灶体积

2.3 各组大鼠血脑屏障通透性水平

两假手术组EB含量均较低,差异无统计学意义(P>0.05)。与sham+DMSO组比较,DMSO组EB含量显著升高(P<0.05)。与DMSO组比较,SB组EB含量明显降低(P<0.05)(表1)。

2.4 p38MAPK和MMP-9表达水平

两假手术组均可见少量p38MAPK和MMP-9表达,而DMSO组和SB组p38MAPK和MMP-9表达均明显升高。两假手术组间比较,p38MAPK和MMP-9表达差异均无统计学意义(CP>0.05)。与sham+DMSO组比较,DMSO组p38MAPK和MMP-9表达量均显著升高(P<0.05)。与DMSO组比较,SB组p38MAPK和MMP-9表达量均明显降低(P<0.05)(图2,表1)。

图2 各组p38MAPK和MMP-9相对表达水平

GroupEB content (μg/g)p38MAPK (OD)MMP-9 (OD)Sham+DMSO0.50±0.030.24±0.010.03±0.003Sham+SB0.48±0.060.23±0.010.029±0.002DMSO7.87±0.34*0.76±0.012*0.28±0.008*SB2.44±0.16△#0.48±0.010△#0.15±0.009△#

*P<0.05vssham+DMSO;△P<0.05vssham+SB;#P<0.05vsDMSO

2.5 各组MMP-9 mRNA反转录扩增产物水平

两假手术组均有少量MMP-9 mRNA反转录扩增产物,差异无统计学意义(P>0.05)。DMSO组和SB组MMP-9 mRNA反转录扩增产物增多,与sham+DMSO组比较,DMSO组MMP-9 mRNA反转录扩增产物显著升高(P<0.05)。与DMSO组比较,SB组MMP-9 mRNA反转录扩增产物则明显减少(P<0.05)(图3)。

3 讨论

3.1 p38MAPK和MMP-9参与脑缺血再灌注损伤

脑缺血再灌注损伤过程中诱导MMP-9表达增加和活化后,降解毛细血管基底膜的胶原、层黏连蛋白和内皮紧密连接的闭锁小带,导致血脑屏障结构破坏,通透性增高,引起血管源性水肿和诱发炎症因子进入脑组织,损害神经细胞[4,13]。p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶通路中的关键蛋白之一,脑缺血再灌注损伤中p38MAPK激活后主要表现为促进细胞的凋亡[14-15],抑制p38MAPK激活可以减轻细胞凋亡,其通过调节Bcl-2和Bax的表达而发挥作用[1]。此外,有研究[16]显示p38MAKP通路激活后可通过影响iNOS而调节NO含量,NO是调节MMP-9表达的一种重要因子[17],在脑缺血再灌注发生时iNOS诱导催化的NO,可以通过影响鸟苷酸环化酶及cGMP的水平对MMP-9进行调节[18]。脑缺血再灌注损伤过程中NF-κB表达升高,并通过激活下游炎症因子如MMP-9等加重脑损伤,而表达增高活化的p38MAPK可与NF-κB通路下游聚合,放大炎症反应,进一步增加MMP-9的表达[19]。

图3 各组缺血侧大脑皮质MMP-9 mRNA相对转录水平

3.2 SB203580降低p38MAPK和MMP-9的表达而减轻高脂血症脑缺血再灌注损伤

本课题组前期研究结果[6-7]显示p38MAPK和MMP-9表达增高参与高血脂加重脑缺血再灌注损伤,且两者均在再灌注24h时表达达到高峰,但未明确在该病理生理过程中p38MAPK是否可调节MMP-9表达,本实验检测高脂血症脑缺血再灌注损伤中p38MAPK和MMP-9的表达量,观察抑制剂SB203580对p38MAPK和MMP-9表达的影响,并结合神经行为学评分、TTC染色和EB染色综合研究。

免疫蛋白印迹结果显示： 两假手术组脑组织中仅有少量p38MAPK和MMP-9表达,在脑缺血再灌注损伤后,p38MAPK和MMP-9表达均明显升高。而使用p38MAPK特异性抑制剂SB203580后,不仅p38MAPK表达降低,且MMP-9表达亦明显降低,差异均有统计学意义。此外反转录PCR结果显示,使用SB203580后MMP-9 mRNA转录水平较使用溶剂DMSO明显降低。在损伤过程中减少p38MAPK表达即可引起MMP-9表达降低,且影响MMP-9表达的转录过程,此与余音等[8]研究结果一致。

伊文思蓝与血浆白蛋白有高度亲和力,在血液内与血浆白蛋白结合形成复合物。正常状态下血浆白蛋白不能通过血脑屏障进入脑组织,当脑组织损伤血脑屏障破坏,其通透性增高,伊文思蓝血浆白蛋白结合形成的复合物即可通过血脑屏障进入脑组织染色。通过检测脑组织伊文思蓝含量可间接了解血脑屏障的完整性、通透性。实验结果显示,两假手术组仅有微量伊文思蓝,这可能是生理盐水灌注不完全,血管内残留的EB。而DMSO组和SB组脑组织EB含量显著增高,提示脑缺血再灌注损伤中血脑屏障破坏,其通透性增高。但SB组EB含量较DMSO组明显降低,说明高脂血症脑缺血再灌注损伤中p38MAPK特异性抑制剂SB203580可降低血脑屏障通透性。这与SB203580抑制p38MAPK表达,进而降低MMP-9表达,减轻对血脑屏障的破坏有关。

TTC染色检测梗死灶体积,结果显示,使用抑制剂SB203580后梗死灶体积较使用溶剂DMSO明显缩小。神经行为学评分显示,抑制剂SB203580可明显改善神经行为损伤症状,评分降低。这可能是因SB203580抑制p38MAPK的表达,进而引起MMP-9表达降低,与p38MAPK和MMP-9表达降低减少细胞凋亡的发生,减轻炎症反应等有关。但高脂血症脑缺血再灌注损伤过程中,p38MAPK究竟通过何途径上调MMP-9表达尚不清楚,有待进一步探究。