陈彦儒 闫璋哲 谭佳禾 赵 娜 崔伟伟 郝 晶△

(1 山东大学医学院组织学与胚胎学教研室； 2 山东师范大学附属中学， 济南 250012; 3 延安大学医学院， 延安 716000; 4 山东省实验中学， 济南 250001)

小肠癌是消化系统中较少见的恶性肿瘤,其中以小肠腺癌最多见[1]。近年来随着生活水平的提高,小肠癌的发病率逐渐升高[2]。胆汁酸是胆汁的主要成分,肠道内95%以上的胆汁酸经顶端钠离子依赖性胆汁酸转运体(apical sodium dependent bile acid transporter, ASBT)介导,重吸收进入血液循环, 并再次排入肠腔, 此过程称为肠-肝循环。编码人ASBT的基因第10溶质转运蛋白家族第2成员SLC10A2缺陷可以造成胆汁酸的肠肝循环中断。文献报道,胆汁酸与消化道肿瘤的发生密切相关[3-4]。Dawson等[5]报道,ASBT可能通过调控胆汁酸肠-肝循环参与肠道肿瘤的发生和发展。Raufman等[6]也报道和野生型小鼠相比,ASBT缺陷小鼠更易诱发结肠癌。ASBT是否和小肠癌发生有关,小肠癌中ASBT表达情况是否发生改变,到目前为止未见相关报道。本研究采用免疫组织化学检测ASBT在人正常小肠和小肠癌组织中的表达情况,为小肠癌的发生机制和分子靶向治疗提供实验基础和新靶标。

1 材料和方法

1.1 材料

小肠癌组织及其癌旁组织各10例，主要取自于山东省立医院,经病理专家诊断为小肠腺癌、小肠黏液腺癌和小肠小细胞癌及其癌旁正常组织。

1.2 主要试剂

ASBT羊抗人多克隆抗体ab134837购自Abcam公司;SABC免疫组织化学检测试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学显色

所有标本经4%多聚甲醛固定,石蜡切片厚7μm,经二甲苯脱蜡,梯度乙醇脱水,3%甲醇H2O2封闭内源性过氧化物酶,水浴锅内96℃～100℃ 30min进行抗原修复。滴加0.01mol/L pH 7.4的PBS稀释的SLC10A2一抗(1∶100),4℃孵育过夜,阴性对照组以0.01mol/L pH 7.4的PBS代替一抗。滴加0.01mol/L pH 7.4的PBS稀释的二抗37℃孵育30min,最后室温下DAB显色,镜下控制显色时间,至阴性对照将着色时为止,苏木精复染2min。期间各步均以0.01mol/L pH 7.4的PBS洗涤3次,每次5min。梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。SLC10A2免疫组织化学显色阳性结果呈棕黄色,阴性对照不显色。

1.4 图像分析

每张切片选10个高倍视野,用彩色图像分析软件Image-pro Plus 6.0对染色结果的平均光密度进行半定量分析。

1.5 蛋白印迹检测目的蛋白

分别提取人小肠癌及其对应的癌旁组织总蛋白, 用Bradford法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳后, 用半干式电转的方法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。5%的脱脂奶粉封闭1h, 分别加β-actin和ASBT(稀释浓度均为1∶1000)一抗,湿盒内 4℃孵育过夜, 用含0.5g/L Tween 20的Tris-HCl缓冲液(TBST)洗膜10min×3 次;分别加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶1000),室温孵育1h,加增强化学发光试剂于暗室自显影。用Image J分析软件测量胶片上每个特异条带的灰度值,并进行半定量灰度分析。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 ASBT在人小肠癌及其癌旁组织中的表达

免疫组织化学显色结果显示,ASBT在癌旁正常组织中主要表达于吸收细胞游离面的细胞膜;在小肠腺癌中,ASBT在游离面和基底面细胞膜及细胞核中都有表达;而在小肠黏液腺癌和小肠小细胞癌中,ASBT在细胞核以及细胞质都有表达,但以细胞核为主(图1A～D)。

免疫印迹结果显示,和相对应的癌旁正常组织相比,ASBT在小肠黏液腺癌、腺癌和小细胞癌中表达均明显下调(图1E)。

分别利用图像分析软件Image-pro Plus 6.0和Image J对免疫组织化学显色结果和免疫印迹结果进行半定量分析,结果显示,和癌旁正常组织相比,ASBT表达在小肠癌各组的平均密度均下调,且差异有统计学意义(P< 0.05)。

3 讨论

肠道内高浓度的次级胆汁酸对肠道黏膜的长期的、反复的慢性刺激是肠道肿瘤发生的重要危险因素。胆汁酸可诱导细胞应激, 细胞凋亡和DNA 损伤, 躲过机体免疫细胞进行的损伤修复;修复失败的细胞在胆汁酸的反复刺激下继续错配复制, 导致细胞突变积蓄,抗凋亡及增殖能力提高, 最终发生癌变[7-8]。动物实验也显示肠内灌注外源性胆汁酸可使肠道上皮异常增生, 诱发癌变[9]。除动物实验之外,很多研究者也在研究胆汁酸和人类肿瘤之间的关系。大量文献报道胆汁酸与人类食管癌[10-12]、胃癌[13]、肝癌[14,15]、胆管癌[16,17]、胰腺癌[18,19]、结直肠癌[20,21]可能有关。

鉴于ASBT在胆汁酸肠肝循环过程中的重要作用,越来越多的研究者也开始关注SLC10A2基因和肿瘤发生的关系。Dawson等[5]报道, 与野生型小鼠相比, SLC10A2基因缺陷小鼠粪便胆汁酸含量显著升高达10 倍以上, 提示肠道胆汁酸转运体可能通过调控胆汁酸肝-肠循环参与到肠道肿瘤的发生和发展中。Raufman等[6]比较野生型小鼠和SLC10A2缺陷小鼠偶氮甲烷诱导结肠癌模型中肿瘤的数量和体积, 显示后者较前者明显增加。

Dvorak等[22]检测了ASBT在Barrett食管和食管腺癌中的表达,结果显示在Barrett食管活检组织中有ASBT表达,且在非典型增生性Barrett食管中表达率较高;随着异型性增生程度增高,ASBT表达进行性减少;在食管腺癌组织中未检测到ASBT的表达。大量证据显示,食管腺癌的发生是从化生的柱状上皮到异型性增生再到恶性逐步演变进行的,即Barrett食管伴有肠化生的属于食管腺癌的癌前病变[23]。

本研究检测了ASBT在人正常小肠和小肠癌组织中的表达,显示ASBT在正常小肠组织中主要表达于吸收细胞游离面的细胞膜;和正常小肠相比,ASBT在小肠腺癌、小肠黏液腺癌和小肠小细胞癌中表达量下调且表达位置发生了改变,即ASBT不仅表达于细胞膜,而且在细胞核、细胞质也有表达,且在小肠黏液腺癌和小肠小细胞癌组织中,ASBT主要表达于细胞核。在Dvorak等[22]的研究显示,ASBT在食管腺癌组织中,也表达于细胞核,这与本研究结果是一致的。

结合文献报道和本研究结果,和正常小肠组织相比,ASBT在小肠癌组织中表达明显下调,且出现异位表达,很可能编码ASBT的基因SLC10A2作为一种新的抑癌基因在小肠癌的发生过程中起重要作用。本研究可以为临床诊断和治疗小肠癌提供新的靶点。

图1 ASBT在人小肠癌及癌旁正常组织中的表达