陈碧珊，吴红卫，李艳，张滨，陈吉生

(广东药科大学附属第一医院，广州510080)

糖尿病肾病是糖尿病最常见且难治的微血管并发症之一，常发展为终末期肾病，是糖尿病患者死亡的主要原因[1]。糖尿病肾病主要表现为肾功能减退及蛋白尿，肾小球细胞外基质(ECM)产生过多及降解不足，导致过度沉积，是糖尿病肾病最显著的病理特征之一[2]。纤维连接蛋白(FN)是ECM的重要成分，也是糖尿病患者肾脏器质性改变的重要早期标志物。Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)作为一条与肾肿瘤及慢性肾病等肾脏疾病发生、发展有关的保守信号通路，参与系膜细胞凋亡及蛋白尿的产生[3]。Dickkopf-1(DKK1)是Wnt/β-catenin信号通路的拮抗剂，能够介导高糖条件下系膜细胞β-catenin的不稳定性及致纤维化因子FN表达[4]。血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂(AT1Ra)厄贝沙坦是治疗糖尿病肾病的药物之一，具有减少蛋白尿、延缓糖尿病肾病进展的作用[5]，但其具体机制尚未明确。2017年1月～2018年3月，本研究观察了厄贝沙坦干预对糖尿病大鼠肾组织FN、DKK1及β-catenin表达的影响，探讨厄贝沙坦抑制糖尿病肾损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级健康雄性SD大鼠32只，体质量200～220 g。厄贝沙坦(安博维，150 mg/片，杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司)；链脲佐菌素(STZ，美国Sigma)；兔抗大鼠 FN多抗(博士德生物工程有限公司)，兔抗DKK1多抗、小鼠抗 β-catenin单抗(美国 Santa Cruz公司)，FN、DKK1、β-catenin引物、逆转录及扩增试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)，小鼠超敏、兔超敏二步法免疫组化检测试剂盒和DAB 液，BCA 蛋白浓度测定及提取总蛋白的试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)。

1.2 糖尿病肾病模型建立及厄贝沙坦干预 32只SD大鼠适应性喂养1周，按随机数字表法选取10只设为正常组，腹腔注射造模用等量无菌枸橼酸钠缓冲液，尾静脉取血测血糖，使血糖稳定在4.7～8.3 mmol/L。其余22只用于造模，给予无菌柠檬酸钠缓冲液(10 mmol/L，pH 4.5)溶解的STZ(终浓度 0. 4%)60 mg/kg左下腹腔注射，72 h后尾静脉取血检测空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L确定为建模成功。结果显示，厄贝沙坦组、模型组、正常组空腹血糖分别为(24.1±2.7)、(26.1±3.0)、(9.6±1.5)mmol/L，厄贝沙坦组、模型组空腹血糖均高于正常组(P均<0.05)。其中20只造模成功，随机分为模型组和厄贝沙坦组，每组10只。厄贝沙坦组给予厄贝沙坦50 mg/(kg·d)灌胃，每天上午9时1次；正常组和模型组在同一时间给予等量双蒸水灌胃。连续每天灌胃给药12周。

1.3 相关指标观察 各组灌胃干预结束后处死。处死前1天用代谢笼收集24 h尿液，-80 ℃冰箱保存。处死前12 h禁食，测量体质量。10%水合氯醛麻醉后于颈主动脉取血2 mL；切取肾脏清洗后吸干水分后称取肾质量，计算肾质量/体质量。将肾脏置冰台上去掉被膜，左肾用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制成4 μm厚切片；右肾置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.1 血尿素氮(BUN)、24 h尿白蛋白/尿肌酐(UACR) 取颈主动脉血，采用ROCHE MODU-LAR全自动生化仪检测BUN；取24 h尿液，采用ROCHE MODU-LAR全自动生化仪检测24 h尿白蛋白、尿肌酐，并计算其比值，即为UACR。

1.3.2 肾组织FN、DKK1及β-catenin蛋白表达 取左肾组织切片，免疫组化法检测FN、DKK1及β-catenin蛋白表达。以PBS代替一抗作为阴性对照。每张切片在400倍光镜下随机选取10个肾小球视野，以Olympus公司图像采集系统与北航医学图像分析管理系统进行半定量分析，分别计算FN、DKK1及β-catenin染色阳性区域面积/整个肾小球面积的比值，并分别以此表示FN、DKK1及β-catenin蛋白表达。

1.3.3 肾组织FN、DKK1、β-catenin mRNA表达 采用实时荧光定量 PCR法检测FN、DKK1、β-catenin mRNA表达。取右肾组织0.1 g使用TRIzol试剂提取肾组织RNA，测定其纯度与浓度。符合要求后根据逆转录试剂盒说明加入反转录cDNA。扩增反应系统采用SYBR Green，每个样品采取3孔平行反应，反应管中分别加入SYBR PremixEx Taq(2×)25 μL，上下游引物各2 μL，ROX Ref-erence Dye(50×)1 μL，cDNA 溶液4 μL，dH2O 16 μL，配制成50 μL反应体系。上机后95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。使用双蒸水代替cDNA模板作为阴性对照。采用2-ΔΔCt法计算FN、DKK1、β-catenin mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 三组肾质量/体质量比较 模型组、厄贝沙坦组、正常组肾质量/体质量分别为(4.7±0.6)%、(3.8±0.5)%、(3.2±0.4)%，三组间比较P均<0.05。

2.2 三组血BUN、UACR比较 模型组、厄贝沙坦组血BUN及UACR均高于正常组，厄贝沙坦组均低于模型组，组间比较P均<0.05。见表1。

表1 三组血BUN、UACR比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.3 三组肾组织FN、DKK1、β-catenin蛋白表达比较 模型组、厄贝沙坦肾组织FN、DKK1蛋白表达均高于正常组，β-catenin蛋白表达均降低正常组(P均<0.05)；厄贝沙坦组肾组织FN、DKK1蛋白表达均低于模型组，β-catenin蛋白表达均高于模型组(P均<0.05)。见表2。

表2 三组肾组织FN、DKK1、β-catenin蛋白比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.4 三组肾组织FN、DKK1、β-catenin mRNA表达比较 模型组、厄贝沙坦组肾组织FN、DKK1 mRNA相对表达量均高于正常组，厄贝沙坦组均低于模型组，组间比较P均<0.05；三组肾组织β-catenin mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

2.5 糖尿病大鼠肾组织DKK1 mRNA表达与UACR、FN mRNA表达的关系 糖尿病大鼠肾组织DKK1 mRNA表达与UACR呈正相关(r=0.796，P<0.05)，与FN mRNA表达呈正相关(r=0.751，P<0.05)。

表3 三组肾组织FN、DKK1、β-catenin mRNA相对表达量比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

FN主要由系膜细胞产生，作为ECM中的重要大分子糖蛋白之一，可与ECM各类成分结合，促使ECM其他成分逐渐沉积[6]。FN表达异常增高反映了ECM的过度累积，是判断糖尿病肾病肾小球硬化与肾间质纤维化的指标[7]。Wnt/β-catenin信号通路具有调控系膜细胞功能的重要作用，介导了糖尿病肾病动物模型的肾脏纤维化[8]。其经典途径可概括为：β-catenin降解复合体解离-β-catenin积累入核-与TCF/LEF相互作用-激活cyclinD1、c-myc等靶基因转录[9]。人DKK1基因位于10号染色体上，不同细胞中提取到的DKK1基因的分子质量不同，多数介于35～45 kU。DKK1是Wnt信号通路的重要调节因子，能够抑制Wnt信号向细胞内传递[10]，DKK1通过Wnt/β-catenin经典信号传导途径以及Wnt非经典信号传导途径在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用[11]。β-catenin是一种多功能蛋白，通过与细胞骨架的相互作用，协助细胞对细胞外的信号作出反应，在细胞核内充当转录因子，启动促使细胞分裂的基因[12]。

厄贝沙坦为AngⅡ受体抑制剂，能抑制AngⅠ转化为AngⅡ，特异性地拮抗血管紧张素转换酶1(AT1)受体，其对AT1受体的拮抗作用大于AT2受体的8 500倍，通过选择性阻断AngⅡ与AT1受体结合，抑制血管收缩和醛固酮释放，发挥降压作用[13]。糖尿病肾病患者体内肾素-血管紧张素系统(RAS)过度激活，AngⅡ分泌显著增加，厄贝沙坦作为AngⅡ选择性的AT1受体拮抗药，可阻断由AT1受体介导的AngⅡ活性，延缓肾脏病变，发挥保护肾脏的作用[14,15]。

本研究结果显示，糖尿病大鼠造模成功12周出现肾质量/体质量、BUN及UACR增加，提示糖尿病大鼠出现肾脏损伤。免疫组化结果显示，模型组FN与DKK1表达均高于正常组，厄贝沙坦治疗后FN与DKK1表达下降，实时荧光定量PCR结果与上述免疫组化结果一致，相关分析提示模型组DKK1 mRNA表达与 FN mRNA表达呈正相关性。提示FN与DKK1可能参与了糖尿病大鼠肾脏 ECM的沉积过程，二者共同参与糖尿病肾病的发生；厄贝沙坦可能通过抑制FN、DKK1表达延缓或抑制糖尿病肾病的发生及进展。本研究结果显示，模型组和厄贝沙坦组β-catenin 蛋白表达显著低于正常组，两组β-catenin mRNA表达与正常组比较差异无明显统计学意义。表明糖尿病状态下β-catenin 蛋白水平降低可能是由于其降解速度增加所致，并非由β-catenin mRNA翻译后蛋白增加引起。β-catenin 蛋白降解增加的原因可能与DKK1表达增加、抑制 Wnt信号途径有关。经厄贝沙坦治疗后，DKK1表达被抑制，β-catenin 蛋白水平有所提升，进而延缓肾脏病变的发展。

综上所述，厄贝沙坦对糖尿病肾病大鼠肾损伤有抑制作用，其机制可能为抑制FN、DKK1表达，促进β-catenin表达。