盛敏佳,赫东芸,王立岩,唐庄艳,仝晓丽

(吉林大学中日联谊医院 妇产科，吉林 长春130033)

据2015年全球数据显示，在发展中国家，宫颈癌位居女性好发肿瘤第四位，仅在中国每年就有13万新发病例及5万死亡病例[1,2]。顺铂是宫颈癌一线化疗药物的首选。然而，宫颈癌细胞对化疗药物的耐药性导致肿瘤的复发及远处转移，因此，我们急需解决化疗药物的耐药性。二甲双胍是II型糖尿病的一线治疗药物，目前被认为具有潜在的抗肿瘤作用，低剂量的二甲双胍在乳腺癌中能有效抑制细胞转化并杀伤肿瘤干细胞，并且二甲双胍联合化疗药物阿霉素能够共同杀伤肿瘤干细胞及肿瘤细胞[3]。在卵巢癌、子宫内膜癌及宫颈癌中二甲双胍可以作为一种抗癌成分来抑制肿瘤细胞增生，研究显示其机制为直接激活AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)，之后抑制哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，从而抑制靶细胞内蛋白的合成及增殖[4,5]。本实验组体外实验也已证实二甲双胍能够通过诱导细胞凋亡及阻滞细胞周期G0/G1期来抑制宫颈癌细胞的增殖，具有抑制肿瘤细胞生长的作用，同时二甲双胍与卡铂联合应用能够增强卡铂对宫颈癌细胞的化疗敏感性[6]。

为了进一步探讨二甲双胍是否可抑制宫颈癌小鼠移植瘤模型肿瘤的生长，本文通过建立宫颈癌U14细胞小鼠皮下移植瘤模型，探讨二甲双胍联合卡铂对小鼠宫颈癌U14细胞的体内抗肿瘤作用。

1 材料与方法

1.1实验动物来源及饲养条件6周龄雌性昆明鼠，20±0.5 g，购自吉林大学实验动物中心，饲养于中国科学院长春应用化学研究所动物房。饲养环境：温度25℃，湿度40-60%，噪音分贝<60分贝，昼夜明暗交替时间为12 h/12 h。

1.2宫颈癌U14细胞小鼠皮下移植瘤模型的构建吸取U14腹水型瘤源鼠腹腔中的腹水型瘤细胞,稀释成1.6×106个/ml,于小鼠右侧后腿背侧皮下接种细胞悬液0.1 ml，接种一周后，对小鼠成瘤情况进行观察，采用电子游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤直径在6 mm左右时，认定为小鼠移植瘤模型构建完成。

1.3实验分组将宫颈癌U14细胞小鼠皮下移植瘤模型进行随机分组，共分为4组，每组9只小鼠：第一组为生理盐水腹腔注射对照组，第二组为二甲双胍腹腔注射组，第三组为卡铂腹腔注射组，第四组为二甲双胍联合卡铂腹腔注射组。

1.4各组治疗方案小鼠皮下移植瘤模型构建完成后，自接种后第8天开始分别给予二甲双胍、卡铂、二甲双胍联合卡铂进行干预。腹腔注射二甲双胍溶液(100/mg/day)，连续给药18天；卡铂50 mg/kg，给药时间1天；对照组小鼠则腹腔注射等量的生理盐水，给药时间为18天。

1.5肿瘤体积及小鼠体重测量给药后每2天用电子游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤的长径和短径(mm)，并以此计算肿瘤体积(V=0.52×长径×短径2)，同时监测小鼠体重(g)。

1.6病理组织学检查实验结束后将小鼠断髓处死，将四组瘤体固定在10%甲醛中，制备HE染色切片,镜下观察各组肿瘤组织细胞形态变化。

1.7统计学处理采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，结果以“均数±标准差”表示，根据实验设计采用t检验进行比较；生存分析采用Kaplan-Meier法；P<0.05表示有统计学意义，P<0.01，差异极显著。

2 结果

2.1宫颈癌U14细胞株小鼠皮下移植瘤体积的影响

实验周期内，U14实验结束后，各组肿瘤体积增长率如图1所示，生理盐水对照组肿瘤体积增长511.4±24.5%，二甲双胍组肿瘤体积增长306.4±37.3%，卡铂组肿瘤体积211.5±9.98%，二甲双胍联合卡铂组肿瘤体积40.4±13.4 mm%。生理盐水腹腔注射组皮下肿瘤体积增长最快，而二甲双胍组、卡铂组肿瘤体积增长与对照组比较缓慢，二甲双胍联合卡铂给药组能够显著抑制肿瘤生长，与二甲双胍组，卡铂组及对照组相比，均具有极显著性差异(P<0.01)。

图1 各组肿瘤体积增长百分率比较

2.2宫颈癌U14细胞株小鼠体重的影响

如图2所示，实验过程中每2日监测小鼠体重，结果显示实验周期内，各组小鼠体重均有所增长，但各组间比较无明显差异，说明二甲双胍联合卡铂腹腔内注射治疗宫颈癌U14细胞株荷瘤小鼠时，当给药剂量后对小鼠无毒性反应。

2.3宫颈癌U14细胞株小鼠皮下移植瘤的组织形态学特征

实验结束后，将4组小鼠移植瘤瘤体固定在10%甲醛中，制备HE染色切片,观察各组肿瘤组织细胞形态变化，对照组少见癌细胞凋亡或坏死，呈典型的巨核、异性核；二甲双胍联合卡铂给药组可见细胞松散，多见局灶性坏死，细胞核深染，呈褐色，另可见细胞核固缩、溶解、碎裂，染色质部分红染。其余2组癌细胞异型性及细胞核裂解、坏死程度介于对照组和联合给药组之间，综上所述，二甲双胍联合卡铂给药能够更好的引起肿瘤组织凋亡和坏死。

图2 各组荷瘤小鼠体重变化比较

图3 各组荷瘤小鼠移植瘤HE染色结果

3 讨论

宫颈癌是目前女性好发的肿瘤之一，手术、放疗及化疗常常单独或联合用于治疗宫颈癌，但生存率仍然不理想。因此，抑制肿瘤侵袭和迁移的重要策略是重新选定药物同时应着重考虑提高患者的整体生存质量和生活质量[7]。由抗癌药物和不同作用机制的药物组成的组合疗法可以产生协同效应，且通常比单一疗法更有效[8,9]。最近的流行病学研究证实口服二甲双胍的糖尿病患者其癌症的发病率及死亡率均降低[10，11]。越来越多的体内、体外试验也证实了二甲双胍对于多种癌细胞具有直接的杀伤作用[12]。有研究将二甲双胍与奈非那韦联合作用于宫颈癌细胞，结果发现当两者单独作用于宫颈癌HeLa,SiHa和 CaSki 细胞株时，其对肿瘤细胞的抑制增殖、诱导凋亡、抑制转移及侵袭作用均较弱，当联合应用两种药物时，这两种药物能够很好的协同抑制人宫颈癌细胞体外生长和裸鼠体内宫颈癌细胞异种移植，并抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭[13]。

大量证据证实二甲双胍对妇科肿瘤如卵巢癌等有较好的疗效，且能改善内皮功能[14]。然而二甲双胍对宫颈癌的作用机制却很复杂，了解这些机制对于充分利用其抗癌潜力至关重要。研究显示二甲双胍可以抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路的表达，并且能够对宫颈癌具有化疗协同作用，对多种肿瘤也具有直接及间接的抗肿瘤作用[15]。二甲双胍能够拮抗促进肿瘤细胞增殖、活动、侵袭和迁移的特定途径[16-18]。二甲双胍能够通过降低胰岛素样生长因子水平，直接激活腺苷单磷酸酶活化蛋白激酶通路，抑制胰岛素信号传导，从而降低肿瘤葡萄糖供应，起到抑制肿瘤生长的作用[19]。二甲双胍另一种抗肿瘤机制是能够抑制MALAT1的表达并诱导miR-142-3p的表达，破坏了宫颈癌细胞核中的MALAT1/miR-142-3p海绵体，导致了miR-142-3p释放到细胞质中，与HMGA2 3′UTR结合，最终抑制了宫颈癌细胞的侵袭及转移[20]。本实验组已将二甲双胍与卡铂联合，应用MTT法、AO/EB染色及流式细胞仪对宫颈癌Hela细胞进行了体外试验研究，结果证实二甲双胍能够通过诱导细胞凋亡及细胞周期G0/G1期阻滞来抑制宫颈癌Hela细胞的增殖，同时二甲双胍与卡铂联合作用于宫颈癌Hela细胞，可以增强其体外抑瘤作用[6]。

本实验将二甲双胍及卡铂单独及联合作用于宫颈癌荷瘤小鼠，结果证实二甲双胍联合卡铂给药能够明显抑制肿瘤体积生长，且不增加化疗药物毒性反应，对肿瘤的抑制作用显著优于其他各组。综上所述，二甲双胍联合卡铂能够能显著抑制宫颈癌U14细胞株小鼠皮下移植瘤的生长，二甲双胍能够增强卡铂的化疗敏感性。本研究结果为宫颈癌化疗以及抑制肿瘤转移和复发的新药物治疗提供一定的理论依据和实验基础。