李佳宸 史雅文 朱华,2 张希龙 殷敏 程雷

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea，OSA）是以夜间反复发生上呼吸道狭窄或坍塌为特征的一种睡眠相关疾病，它直接导致通气减少或呼吸暂停，血氧饱和度下降以及睡眠破碎[1]，继而引发心脑血管等全身多系统的一系列疾病。觉醒状态下上气道的最小口径位于口咽部，而OSA患者的上呼吸道口咽部更狭小[2，3]，而口咽部气道的开放依赖于上气道扩张肌的有效收缩。颏舌肌是其中最大也是最主要的扩张肌[4]。健康人群睡眠时颏舌肌活性具有下降趋势，这种趋势在OSA患者中更为明显[6]，而在觉醒期OSA患者颏舌肌的活性较正常人显著地增加[5]，这可能是对上气道狭窄的一种代偿机制。颏舌肌等上呼吸道肌群的活动受舌下运动神经元（HMNs）支配，后者在维持气道通畅性方面发挥关键作用。HMNs活性降低会导致咽肌张力减弱，气道阻力增加从而导致上呼吸道闭合。因此，HMNs对于保持上呼吸道开放至关重要。舌下运动神经元受一系列神经调节递质的调控，如组胺、去甲肾上腺素、5羟色胺等激动性神经调节递质，甘氨酸、γ氨基丁酸等抑制性神经调节递质[7]。我们的前期研究表明，5-HT在HMNs的调控中发挥重要作用，尤其在慢性间歇性缺氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）环境下，5-HT受体在舌下神经核腹侧核团的表达增高，提示在OAS的发生发展中，可能发挥重要的代偿功能[8]。

另一方面，硫化氢（H2S）在中枢神经系统调控中的作用被逐渐关注。生理浓度的H2S具有多种生理学功能，它被认为是继CO、NO之后的另一种新型气体信号分子[9]，在机体内多个系统中发挥着重要作用。哺乳动物体内的H2S主要是以L-半胱氨酸为基质，分别由胱硫醚-β-合酶(cystathionine-β-synthase,CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶 (cystathionine-γlyase,CSE)、3-巯基丙酮酸硫转移酶 (3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3MST)催化合成H2S。CBS和3MST主要表达在中枢神经系统中[10，11]，而CSE主要表达在血管壁组织及心肌组织中[12]。H2S在中枢神经系统中发挥抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用[13]，所以它被认为是中枢神经系统中的一种重要神经调节保护气体分子。

研究提示H2S参与延髓呼吸中枢的调控中可能发挥重要作用。Hu等[14]在向鼠脑延髓切片中灌注NaHS（外源性H2S供体）后发现舌下神经根分支电位明显提高，而在灌注CBS抑制剂后电位又下降，提示CBS-H2S参与大鼠中枢节律性呼吸的调节。同时，H2S还可能参与缺氧条件下对延髓呼吸中枢的保护过程，Pan等[15]将延髓切片置于5%氧浓度的环境中10min后，舌下神经根分支电位明显下降，而用NaHS灌注后其电位再次提高，硫化氢对呼吸活动产生兴奋作用，逆转由缺氧引起的呼吸电位抑制作用。Donatti等[16]通过向鼠脑延髓包钦格复合体内微注射CBS抑制剂和NaHS，发现CBS-H2S可以抑制急性缺氧诱导的肺过度换气。同样的，Li等[17]发现通过向大鼠脑室内注射NaHS或L-半胱氨酸（LCys，H2S底物）可以防止急性缺氧大鼠发生呼吸抑制作用。这些都提示H2S可能会保护髓质呼吸中枢免受急性缺氧引起的损伤。由于延髓包括较多核团，同时这些研究是针对急性缺氧而并非针对CIH。因此，CIH环境下，H2S对舌下神经核团究竟是否发挥保护性作用，H2S究竟是否参与缺氧时舌下神经核的调节，目前尚无研究讨论。因此，我们研究大鼠舌下神经核中H2S合成酶在CIH条件下的表达变化，从而探讨H2S参与OSA上呼吸道肌群调控的可能机制。

材料与方法

1 动物和造模

取12只8周龄的健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，体质量180～200g，由江苏省动物实验中心提供。按照实验要求随机分为间歇性低氧组（CIH组）和常氧对照组（Control组）。8:30将CIH组大鼠放入低氧箱中，通过周期性通入氮气和空气使低氧箱中的氧浓度在5%～21%之间循环，每一循环2min，前60S通入氮气使低氧箱中氧浓度逐渐下降至5%，后60S通入空气使箱内氧浓度逐渐恢复至21%。16:30将箱内大鼠取出，放回常氧室内饲养。此循环每天持续8小时，连续35天。对照组置于常氧环境中饲养。两组大鼠自由摄食、进水，饲养于南京医科大学动物中心SPF环境中。

2 RT-PCR和Western blot的实验取材

将12只大鼠（每组各6只）以2%戊巴比妥钠（4mg/100g）麻醉后立即断头，快速将脑干分离，根据Yu[18]的方法将左右两侧舌下神经核组织分离出。根据Paxinos and Watson[19]图谱选取舌下神经核所在的横断面，用微穿刺针提取舌下神经核组织，立即置入液氮中，存放于-80度冰箱中。整个提取操作都在冰上完成。

3 反转录-聚合酶链反应及免疫印迹试验

3.1 RT-PCR

采用β-actin作为内参通过逆转录PCR（RTPCR）测定3MST,CBS and CSE mRNA的表达量。将从舌下神经核组织中提取的RNA样本通过紫外分光光度计测定浓度和纯度。检测结果提示OD260/OD280比值在1.8～2.0之间时，RNA的质量符合要求。将提取的RNA配置成20μl反转录体系，置于37℃水浴锅1h，再置于72℃水浴锅10min，冷却后用于在八排管中配制20μl的反应体系。3MST上游引物：5’-CGGCGCTTCCAGGTAGTG-3’，下游引物：5’-CTGGTCAGGAATTCAGTGAATGG-3’；CBS 上游引物：5’-CTCCGGGAGAAGGGTTTTGA-3’，下游引物 ：5’-CATGTTCCCGAGAGTCACCAT-3’；CSE 上游引物：5’-GCTGAGAGCCTGGGAGGATA-3’，下游引 物 ：5’-TCACTGATCCCGAGGGTAGCT-3’；β -actin 上游引物：5’-ACCCGCGAGTACAACCTTCTT-3’，下游引物：5’-TATCGTCATCCATGGCGAACT-3’。扩增反应采用35个循环，每个循环具体如下：95℃变性持续15秒，60℃退火持续30秒，72℃延伸持续30秒。PCR结束后行数据分析，循环阈值（Ct值）取平均值，利用待测样品的Ct差值，通过计算公式2-ΔΔCt法求得相对值即为该基因在该样本中的相对表达量。

3.2 Western blot

采用GAPDH作为内参通过蛋白质印迹法(Western-blot)测定3MST和CBS蛋白的表达量。以1:100的比例向预冷的RIPA裂解液中加入混合蛋白酶抑制剂cocktail，充分混匀后，冰上静置。每5mg组织中加入300ul蛋白裂解液，充分混匀，超声破碎后冰上静置10min。4℃12,000转离心15分钟，取上清即可得蛋白样品，采用CBA法测量蛋白样品的浓度。以1∶4的比例向蛋白样中加入蛋白上样缓冲液，混匀后100℃水浴锅中煮沸5分钟。使用12.5%SDS-PAGE凝胶，每样孔中加入20ug蛋白样，先在60V电压下上分离60分钟，再在120V下分离40～60分钟。将SDS-PAGE凝胶转移到PVDF膜上（Bio-Rad laboratories，Florida，USA） 在 300mA 下转膜80分钟。室温条件下5%脱脂牛奶震荡孵育2小时。将条带放入抗 MPST（1:100,ab85377）；抗 CBS（1∶5000，ab140600）中，4℃摇床孵育过夜。取出条带，室温下TBST震荡洗涤三次，每次10分钟。室温条件下将条带放入二抗（山羊抗兔抗体，1∶5000，CST，USA）中，震荡孵育1.5小时。取出条带，室温下TBST震荡洗涤三次，每次10分钟。随后曝光。避光条件下配制ECL-plus显影液，混匀后，均匀滴在PVDF膜上，使用Bio-Rad ChemiDoc凝胶成像系统进行曝光，获得实验结果。

4 统计学处理

用ImageJ图像分析软件采集灰度值，用SPSS18.0统计软件进行统计分析，结果均以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本 t-test，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1 舌下神经核中H2S三种合成酶（3MST，CBS，CSE）的mRNA表达量

通过RT-PCR技术发现三种合成酶在舌下神经核均有表达。在CIH条件下，3MST和CBS合成酶mRNA的表达量明显低于对照组（P<0.05），而CSE mRNA的表达量与对照组没有统计学差异（P>0.05，图 1）。

*：与 Control组相比 P＜0.05；**：与 Control组相比 P＜0.01

2 舌下神经核中3MST和CBS蛋白的表达量

利用Western-blot技术来检测舌下神经核中3MST和CBS蛋白的表达。在CIH组，舌下神经核中3MST和CBS蛋白的表达量均低于对照组（P<0.05，图 2）。

图2舌下神经核中3MST和CBS蛋白的表达量

讨论

初步研究结果显示，H2S的3种合成酶在舌下神经核中都有表达，但CIH组3MST和CBS在舌下神经核中的表达明显下调。

H2S作为一种新型的体内气体信号分子，近些年它在中枢神经系统中的重要作用已逐步受到关注，如管理脑中突触的活动[20]，通过下丘脑-垂体-肾上腺轴来调节神经内分泌[21]。内源性H2S在脑中的浓度达到50～160um，远高于它在血清中的浓度（＜46um）[22]。生理浓度的H2S参与呼吸活动的调节，H2S可以通过提高cAMP水平使延髓呼吸中枢兴奋[14]。在急性缺氧状态下，H2S可以通过激活KATP通道，抗氧化以及下调C-fos等途径保护呼吸中枢[15]，内源性和外源性的H2S都能减少缺氧对延髓呼吸中枢造成的损伤[23]。TalaeiF等[24]也发现通过CBS/H2S途径可以减少缺血再灌注对组织造成的损伤。但这些研究主要是在鼠脑的延髓水平开展，而延髓中包含舌下神经核、疑核、面神经核、包钦格复合体等众多区域，H2S是否在缺氧时对其中具体每个核团都发挥保护作用，目前尚无明确定论。

既往文献提示，H2S对多种组织在急性缺氧时提供了保护性作用。而OSA的病理生理特征是慢性间歇性缺氧，而CIH对脑组织所造成的伤害是与持续性缺氧或者急性缺氧不同的[25]。因此，舌下神经核作为一个与OSA发病机制密切相关的核团，在处于CIH条件下时，H2S究竟对其发挥着什么样的作用，值得我们关注。

本研究中我们发现CIH条件下舌下神经核中3MST和CBS mRNA和蛋白的表达量均明显降低，推测H2S的合成减少，舌下神经运动元在缺氧时受到的保护作用因此减弱导致其受损加重。在相关研究中，Li等[26]通过测定大鼠延髓中H2S浓度、3MST mRNA及3MST蛋白发现CIH导致大鼠延髓各核团中3MST和H2S的表达均提高，这与我们的研究结果相反。我们推测这一结果可能与CIH程度和时间有关，在Li等[26]的研究中，每天6小时CIH环境并持续了14天，而我们的研究中每天8小时CIH持续了35天。相对而言，Li的研究中CIH造成损伤可能处于一个相对代偿的状态，所以H2S相关合成酶的表达是增加的。而我们的研究中CIH程度更重，可能使组织损伤到了失代偿状态，因此它的表达出现减少的趋势。对舌下神经核而言，何种程度CIH造成的损伤可被完全代偿，进而对整体而言，何种程度OSA引起的损伤是机体失代偿的开始，值得基础和临床研究的关注。由于目前相关文献较少，针对这一现象及推测，尚且需要进一步研究的证实。

以慢性间歇性缺氧为特征的OSA会使舌下神经核中H2S的调节逐渐失代偿，H2S的表达量下降，对舌下运动神经元的保护作用减弱，舌下运动神经元的兴奋性降低，对口咽部扩张肌的调控作用减弱进而引起上气道狭窄。这可能是加重OSA的发病机制之一。我们猜测H2S对舌下神经核的保护机制可能与其抗氧化、抗凋亡作用相关[17]，这有待在今后的研究中进一步加以验证。

文献报道，H2S在OSA这种疾病中也并非完全发挥正向积极的作用。H2S可以刺激颈动脉体感觉神经，从而启动颈动脉体化学感受器，使其处于兴奋敏感状态。临床研究表明，颈动脉体化学反射的过度活动是OSA的一种重要驱动因素[27]。Peng等[28]发现在自发性高血压（SH）大鼠中，CSE-H2S驱使颈动脉体化学感受器兴奋从而会导致睡眠呼吸暂停，当对其使用CSE抑制剂后，大鼠呼吸情况变的平稳，OSA缓解。我们认为，这主要因为H2S通过CSE发挥了作用，而后者主要表达于心血管系统中[12]。尽管在中枢神经系统中CBS与3MST占主导地位[10，11]，但外周H2S发射通路的存在，并且后者可能通过颈动脉体化学感受器发射来调控呼吸，这提示我们在将来的研究中，更要考虑到这外周与中枢H2S催化合成通路中可能存在的交互影响。

本研究发现硫化氢的3种合成酶均存在于成年大鼠的舌下神经核中，并且CIH明显抑制了3MST和CBS在其中的表达。这一结果提示，CBS与3MST-H2S通路可能参与调节舌下神经核相关的呼吸活动。但这一作用是否与CIH程度和作用时间存在潜在相关，同时是否与外周H2S合成通路有一定交互作用，尚且需要进一步研究来证实。