施 龙,丁留成，薛 珺，熊 宇，卫中庆

南京医科大学第二附属医院(南京 210000)

主题词 糖尿病 实验动物 四磨汤 大鼠

糖尿病膀胱功能障碍是糖尿病的常见并发症，可引起多种膀胱功能损害，包括感觉功能障碍、逼尿肌反射亢进或减退、收缩力增强或减弱，逐渐进展为糖尿病神经源性膀胱，患者生活甚至生命受到很大威胁[1]。膀胱逼尿肌、尿道、自主神经和尿路上皮等结构的功能紊乱是目前许多国内外专家学者认可的主要原因[2]。中医将其归为“消渴”、“癃闭”、“淋证(劳淋)”一类，表现为本虚标实之证，因气郁、血瘀、水停、阴阳虚衰最终导致肾与膀胱发生病变，与肺、脾联系紧密。临床表现为尿等待、尿无力、小便频繁但尿量少，重者出现排尿困难、尿潴留，有时也表现为尿失禁。消渴日久，主要是因为肾气受损，阴阳失调，使中气下陷或命门火衰，无法蒸腾气化，最后致使膀胱尿道功能障碍[3]。四磨汤口服液是依照明代《痘疹金镜录》中的四磨汤研制出来的，由槟榔、枳壳、木香及乌药组方而成，该方药物组成虽简单，但已普遍用于内外妇儿各科并且获得了良好的治疗效果。吴深涛根据该病出现排尿异常之体征及“久病脾肾阳虚”之病机，在宋代严用和《济生方》四磨汤合少腹逐瘀汤加减，意在扶正固本，温阳化气，通调水道，患者不仅排尿症状得到很大的改善，且对防治尿路感染有一定作用[4]，但其具体的作用机制尚未阐明。本文运用四磨汤口服液对糖尿病膀胱模型大鼠进行灌胃治疗，从而探讨四磨汤口服液对糖尿病膀胱大鼠膀胱相关压力参数的影响及通过组织层面上HE染色、Masson染色的观察，为其临床诊治提供新的方法。

材料与方法

1 材 料

1.1 实验对象:SD雌性大鼠，体重160～220 g，南京大学动物实验中心提供，许可证号:SYXK(苏) 2016-0002;实验大鼠在南京医科大学动物实验中心进行喂养，符合SPF级要求，许可证号: 2016-0016。

1.2 实验试剂与仪器:链脲佐菌素(streptozocin,STZ)、柠檬酸、柠檬酸钠、四磨汤口服液，血糖测定仪与血糖试纸均购于美国强生公司，尿动力学分析仪(MedLab生物信号采集处理系统V6.5),DXL-D大鼠新型代谢笼(南京医科大学动物实验室)，电子称(南京医科大学五台动物房)；无水乙醇；石蜡包埋机(型号KD-BM)；石蜡切片机(Thermo scientific, FINESSEME+)、二甲苯(国药集团，100023418)、苏木精液染色(海贝索生物技术有限公司，BA-4097)、Masson三色染色液(武汉谷歌生物科技有限公司，G1006)、显微镜(Leica DMR);染色机(Lecia ST5010)。

2 实验方法

2.1 造模：适应性喂养1周后，健康对照组正常喂养，糖尿病模型组大鼠依据体重一次性腹腔注射50 mg/kg浓度为1%的STZ溶液(柠檬酸和柠檬酸钠按照1∶1配置而成的缓冲液，pH4.2)，3 d后剪尾采血，测血糖>16.7 mmol/L表明造模成功。

2.2 实验分组和灌药：将34只SD大鼠随机分为健康对照组10只，糖尿病模型组、四磨汤治疗组各12只。四磨汤治疗组经换算每日一次四磨汤口服液按7.56 /ml(kg·d)，灌胃12周。

2.3 观察对象：行为学表现，动物毛发的色泽、活动状况、饮水量、饮食量、体重变化、精神状态等。糖代谢情况，定期测定血糖，应用代谢笼记录饮食量、排尿量、饮水量等参数。尿动力学检测，每组大鼠按照12 m1/kg腹腔注射3.6%水合氯醛，先行下腹部膀胱顶部造瘘，导管插入后封闭瘘口，通过三通管使导管与压力感受器和微量灌注泵连接，排空小便后，以30 ml/h的速度向膀胱泵入常温等渗盐水，当排尿时，灌注暂停,记下排尿时间、逼尿肌压等，并通过计算得到膀胱顺应性数值。膀胱组织形态学观察即大鼠处死后取出膀胱组织，4%多聚甲醛固定，无水乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切成约4 μm的组织片，常规苏木素-伊红(HE)、麦松(Masson)染色，光镜观察。

结 果

1 行为学表现 健康对照组大鼠饮食正常，体重增加，毛发颜色致密，有光泽。各糖尿病模型组大鼠出现 “三多一少”的糖尿病征象，并伴有精神萎靡、活动低下、毛色晦暗等。健康对照组大鼠没有死亡的现象，糖尿病模型组、四磨汤治疗组大鼠分别死2和4只，可能与STZ使胰岛B细胞大量破坏、大鼠很难耐受持续高血糖状态有关。第0周时，各组大鼠体重无明显差别(P>0.05)，造模后第8周和第12周时，糖尿病模型各组大鼠体重与健康对照组大鼠相比偏低(P<0.05)，见表1。

表1 不同时间各组大鼠体重比较(g)

2 四磨汤口服液对血糖的影响 造模第0周(即STZ注射第3天)时，糖尿病造模各组大鼠血糖明显上升，与健康对照组相比有明显的统计学差别(P<0.05)，提示糖尿病大鼠模型制备成功。血糖在造模组中不同时段无明显差别，提示模型相对稳定(P>0. 05)，见表2。说明书明确表明强生血糖仪的测量上限为27.80 mmol/L，超过此值显示为“High”，所以上述部分组别血糖值用(27.80±0.00) mmol/L标记。

表2 各组大鼠血糖比较(mmol/L)

3 代谢相关指标 代谢笼指标提示12周时糖尿病大鼠的食物摄入量、尿量和饮水量都高于健康对照组(P<0.05)。四磨汤治疗组食量、尿量和饮水量与糖尿病模型组比较无统计学差异(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠代谢笼指标比较 (g)

4 尿动力学 模型组排尿时间(5.42±1.04)s、顺应性(5. 75±0.94)s/mmH2O指标上较健康对照组(2.12±0.45)s、(1.48±0.37)s/mmH2O明显增加，且最大逼尿肌压(53.44±4.28) mmH2O也较健康对照组(63.50±2.92)mmH2O明显下降，两者比较具有明显差异(P<0.05)。四磨汤治疗组在大鼠排尿时间(2. 94±0.25)s和顺应性(2. 61±0.51) s/mmH2O优于模型组(P<0.05)。见表4。

表4 第16周时各组大鼠尿动力学指标比较

5 残余尿量及膀胱湿重 与健康对照组相比，模型组与四磨汤治疗组残余尿量与膀胱湿重明显增加，二者之间有明显差异(P>0.05)。四磨汤治疗组和模型组相比，治疗组大鼠残余尿量和膀胱湿重较各组有改善趋势但与模型组比较无统计学差别(P>0.05)。见表5。

表5 第16周时每组大鼠残余尿量及膀胱湿重比较

6 膀胱组织形态学结果 HE染色图片以光镜观察各组大鼠的膀胱组织，可以见到健康对照组大鼠的膀胱逼尿肌肌束排列紧密，细胞大小及形态正常，肌束间隙致密有结缔组织，神经束易见。其余各造模组大鼠的膀胱逼尿肌层有增厚现象，肌细胞肥大，形态多样，肌束排列紊乱有断裂，结构松散，肌束间间隙明显增宽，血管有充血，神经束减少。说明糖尿病大鼠的膀胱结构明显异常，经过药物治疗后可改善糖尿病膀胱的形态。Masson染色图片示：平滑肌肌纤维含量显著减少，细胞外纤维化增多，治疗组大鼠与模型组相比纤维化有一定的改善。

讨 论

糖尿病神经源性膀胱是糖尿病晚期的严重并发症，主要是高血糖导致的肌源性及神经源性病变和多尿引起逼尿肌收缩功能受损[5]。糖尿病膀胱神经病变主要包括植物神经病变，膀胱感觉神经功能障碍，胆碱能(主要是M受体尤其是M3受体介导)和非胆碱能神经方面障碍[6]。有报道[7]膀胱舒张功能障也是植物神经病变的重要组成部分，糖尿病膀胱逼尿肌损害出现在各个时间段内且每个时间段内B3受体含量都增加，在糖尿病膀胱病变的过程中肾上腺素能B3受体有着重要的意义。戴迟兵等[8]认为自主神经病变、平滑肌病变、肠道Cajal细胞的缺失都是糖尿病胃动力障碍的病因，而胃肠激素分泌失调，如SP(substance P)、VIP(vasoactive intestinal peptide)及nNOS(neurogenic nitric oxide synthase)的失调也是糖尿病胃动力障碍的致病因素，新近发现的胃肠激素Ghrelin阳性神经元在糖尿病模型中有减少趋势，CGRP(calcitonin gene-related peptide)随着糖尿病病程波动也可能与糖尿病胃肠动力障碍有关，四磨汤口服液可以针对上述部分病因改善糖尿病胃轻瘫的症状。四磨汤口服液由槟榔、枳壳、木香及乌药组方而成，且单药研究发现槟榔和枳壳的活性成分槟榔碱和橙皮苷都可加强胃肠平滑肌收缩[9]。李绍磊等[10]认为四磨汤口服液具有类似M受体激动剂效应，主要是通过M3受体介导。有人报导膀胱逼尿肌细胞中的M受体主要是M2和M3受体且M3受体可直接参与逼尿肌细胞收缩，与M受体激动剂结合后会诱导逼尿肌细胞的收缩[11]；糖尿病膀胱时膀胱内的激素分泌也会失调，如SP、VIP、nNOS及CGRP等[12],四磨汤口服液是否会通过该途径影响糖尿病膀胱逼尿肌的功能尚需进一步研究。依据测定的血糖值，各造模组之间空腹血糖的差别无明显统计学意义，所以四磨汤口服液灌胃对大鼠体内高血糖状态并无明显影响，表明四磨汤口服液无法彻底阻断糖尿病膀胱的发生，但四磨汤口服液灌胃后对糖尿病膀胱发生起到一定的保护作用，增加逼尿肌的收缩强度，进而改善糖尿病膀胱排尿障碍。但是四磨汤口服液如何对糖尿病膀胱产生作用，目前尚未明确。本研究通过观察四磨汤口服液灌胃干预大鼠糖尿病膀胱后通过尿动力学中重要参数的变化及通过组织层面上HE染色、Masson染色的观察，以初步探讨四磨汤口服液对糖尿病性膀胱大鼠膀胱排尿功能的改善作用机制。

实验第0周时，各糖尿病大鼠体重明显减轻，血糖显著升高，尿量、食量及饮水量明显增加，说明糖尿病大鼠模型造模成功;第16周时，糖尿病大鼠残余尿量及膀胱湿重显著增加，表明糖尿病大鼠已出现糖尿病膀胱功能障碍的征象。糖尿病大鼠膀胱湿重与健康对照组比较明显增加，可能是多尿、膀胱逼尿肌功能障碍和神经病变，致使膀胱逼尿肌肥厚，间质和胶原成分增加。尿动力学检查发现模型组大鼠排尿时间明显延长、排尿过程中最大逼尿肌压降低、残余尿量增加，表明逼尿肌收缩功能受损，也从功能学方面印证了造模的成功，为四磨汤口服液干预糖尿病膀胱的研究提供了良好的动物模型。受限于大鼠膀胱有限的体积，非麻醉情形下置入测压管并固定有一定的难度，所以本实验选择在麻醉状态下进行尿动力学检查，与清醒状态下的该检查结果有一定的差异，将来我们会进一步改进大鼠尿动力学检查。

在本研究实验第16周，四磨汤口服液治疗组大鼠的膀胱排尿时间、顺应性、湿重及残余尿量，均低于糖尿病模型组，可见四磨汤口服液可改善糖尿病膀胱排尿功能障碍。本实验尚需检测大鼠膀胱组织的受体水平，从而从分子机制水平做进一步分析，探讨四磨汤口服液是通过哪种途径来改善糖尿病膀胱排尿功能。大鼠残余尿量是排尿后通过膀胱测压管抽空膀胱内剩余尿液来计量的，因膀胱测压管中有等渗盐水会导致健康对照组大鼠残余尿量增加，也是导致测量误差的原因之一，以后我们将改进。通过组织层面上HE染色、Masson染色的观察，可以看出经过四磨汤药物治疗后可改善糖尿病膀胱的形态及逼尿肌纤维化的程度。

本研究表明四磨汤可在不干扰血糖的情况下，改善糖尿病膀胱逼尿肌功能，对改善糖尿病膀胱功能障碍有一定的作用。未使用降糖药物作为基础干预手段、没有进行膀胱组织形态学的检测以及四磨汤口服液没有进一细化低、中、高浓度对糖尿病膀胱的影响是本实验研究的不足之处。今后打算在该方与降糖药联合应用、分子作用机制、方药量效等方面作进一步研究，从而为防治糖尿病神经源性膀胱提供更多方法。总之，在糖尿病导致糖尿病膀胱形成的过程中，膀胱逼尿肌功能障碍起着非常重要的作用。四磨汤口服液可通过增强逼尿肌收缩力和减少残尿量有助于改善糖尿病膀胱排尿功能障碍。因此，四磨汤口服液可能成为早期糖尿病性膀胱功能障碍潜在的治疗手段之一。