李清梅，袁名权，陈 虎，罗 荣，段显荣，秦榜勇（遵义医学院麻醉医学院，贵州遵义563003）

肺内炎性细胞和细胞因子介导的肺泡毛细血管膜损伤可导致肺水肿的发生，进一步发展可引起急性肺损伤（ALI），其中多形核中性粒细胞（PMN）在肺内的聚集和激活是脂多糖（LPS）所致ALI最常见的病理学改变和导致肺损伤的机制[1]。

FK866（又名 APO866或 WK175）是 2003年由HASMANN等[2]采用美国国家癌症研究所建立的筛选方法发现的前B细胞集落增强因子（PBEF）抑制剂，能特异性非竞争性抑制PBEF。PBEF通过介导炎性细胞因子产生，抑制PMN凋亡，调控肺血管内皮细胞和上皮细胞的通透性，在ALI中起十分重要的作用[3]。MATSUDA等[4]研究数据提示，PBEF可能是炎性通路中的信号传递者，其作为炎性细胞因子，通过激发其他炎性细胞因子的表达，在ALI的发病机制中起重要作用。而PBEF的特异性非竞争性抑制剂FK866能否通过对PBEF的抑制作用，减轻肺内炎性细胞因子的表达和释放，对ALI产生保护作用，还有待进一步验证。本研究拟通过LPS诱导大鼠ALI模型，观察给予FK866干预后对大鼠ALI的影响，从而探讨PBEF在ALI中的相关作用机制，同时为ALI的治疗提供新的思路。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 无特定病原体（SPF）级健康雄性SD大鼠，平均体重（250±30）g。由中国人民解放军陆军军医大学大坪医院动物实验中心提供，许可证号：SCXK（渝）2012-0005。

1.1.2 主要实验试剂 LPS（E.Coli 055：B5）Sigma-L2880，FK866，二甲基亚砜（DMSO），戊巴比妥钠。

1.1.3 药物配制 （1）LPS：每支 10 mg，加生理盐水（NS）溶解至20 mL，旋涡振荡器混匀，药物水平为0.5 mg/mL，4 ℃冰箱保存，一周内用完。（2）FK866：每支5 mg，加DMSO溶解至5 mL，旋涡振荡器混匀，药物水平为1 mg/mL，4℃冰箱保存，24 h内用完。

1.2 方法 将健康雄性SD大鼠50只随机分为5组，每组10只，分别为NS对照组NS+NS（A组）、单纯给药组 NS+FK866（B 组）、ALI模型组 LPS+NS（C 组）、药物干预组LPS+FK866（D组）及溶媒对照组LPS+DMSO（E组）。经尾静脉注射LPS 5 mg/kg成功制作大鼠内毒素ALI模型。给药6 h后，5组动物均腹腔内注射2.5%戊巴比妥钠1 mL/kg麻醉生效后，开胸取左上肺叶；一部分肺组织10%甲醛液中固定肺组织，脱水、石蜡包埋后切片，苏木精-伊红（HE）染色光镜下观察其病理变化；另一部分肺组织匀浆后采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计学处理，计量资料以表示，进行ONE-WAY ANOVA处理，方差齐使用LSD法，方差不齐使用Dunnett′T3法进行组间比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大体行为变化 A组大鼠自由活动、摄食、饮水、口唇颜色、毛发、呼吸频率等无改变。B组大鼠大体行为变化与A组相似。C组大鼠呼吸急促，口唇发绀，眼半闭，精神萎靡，活动力差，毛发糙乱，刺激不活动，未见摄食、饮水，鼻腔内偶见粉红色泡沫痰，听诊肺部闻及大面积啰音，偶见血性尿。D组大鼠呼吸稍促，精神萎靡，刺激可见有少许活动，偶而可见饮水，听诊肺部可闻及啰音。E组大鼠大体行为变化与C组相似。

2.2 肺组织病理形态变化 A、B组大鼠肺组织的结构清晰完整，肺泡壁光滑、肺泡腔及间质基本无液体及红细胞渗出，肺泡间质无增宽及炎性细胞浸润，见图1、2。C、E组大鼠肺组织结构紊乱，肺间质明显增宽，肺间质可见大量炎性细胞及红细胞渗出，肺泡腔见大量渗出液，大量肺泡腔塌陷及肺泡壁断裂，见图3、4。D组大鼠肺组织肺间质增宽，大量炎性细胞浸润及红细胞渗出，肺泡腔见大量渗出液，部分肺泡壁断裂，局部肺泡腔塌陷，但较C、E组有所减轻，见图5。

2.3 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-β蛋白水平比较 与A、B组比较，其余各组TNF-α及IL-1β水平均明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与 D 组比较，C、E组TNF-α及IL-1β水平均明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。A组TNF-α及IL-1β水平与B组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。C组 TNF-α 及 IL-1β 水平与E组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

图1 A组肺组织HE染色（200×）

图2 B组肺组织HE染色（200×）

图3 C组肺组织HE染色（200×）

图4 E组肺组织HE染色（200×）

图5 D组肺组织HE染色（200×）

表1 各组大鼠肺组织TNF-α及IL-1β蛋白水平比较（±s，ng/L）

表1 各组大鼠肺组织TNF-α及IL-1β蛋白水平比较（±s，ng/L）

注：与 A、B 组比较，aP＜0.05；与 C、E 组比较，bP＜0.05；与 D 组比较，cP＜0.05

组别A组B组C组D组E组n 10 10 10 10 10 TNF-α 148.70±14.75bc 141.87±10.81bc 243.80±9.59ac 214.80±8.23ab 247.69±12.28ac IL-β 19.77±2.67bc 19.95±3.08bc 33.80±3.32ac 26.90±2.65ab 35.16±3.68ac

3 讨 论

临床上，严重感染、创伤、休克等多种情况均可能导致失控性全身炎症反应综合征（SIRS），诱发ALI。其中，严重内毒素脓毒症所致ALI的发生较为常见。有研究显示，LPS作为重要的促炎因子，可通过上皮细胞TOLL样受体 4（TLR-4）激活NF-κB通路参与炎性反应[5]。本实验经尾静脉注射LPS成功制作大鼠ALI模型。近期研究发现，PBEF作为一种新的炎性细胞因子与ALI病理生理密切相关。PBEF能促进肺泡上皮损伤，增加肺泡通透性[6]。而FK866作为PBEF的特异性抑制剂[4]，能通过非竞争性结合PBEF，抑制其酶活性，发挥抗炎性反应作用。参考文献[7]报道，FK866的用药剂量为10 mg/kg，根据LPS和FK866的用药剂量，可换算出每只老鼠注射2种药的容量均为10 mL/kg。

TNF-α是ALI炎性失控机制中的关键细胞因子，被认为是全身性炎症反应的始动介质，也是导致ALI加重的重要因子。其中，TNF-α是启动急性炎性反应的主要细胞因子。有文献报道，TNF-α会产生过多可破坏溶酶体，从而导致肺血管内皮细胞和上皮细胞损伤[8]。有研究观察到炎性细胞因子TNF-α等能够促进PBEF的表达[9]。有研究发现，LPS可诱导小鼠肺组织中IL-6和 TNF-α 水平增多[10]。VAN-GOOL 等[11]研究表明，在许多炎性疾病中，TNF合成受到PBEF影响，PBEF通过Sirtuin家族Sirt6途径在转录后水平提高，增加了TNF的合成产量。ESPOSITO等[12]的实验结果表明，腹腔注射FK866可减轻压缩性脊髓损伤小鼠模型的脊髓炎性反应和损伤程度，纠正损伤部位PBEF的高表达水平，降低病灶周围TNF-α、IL-1β水平，维护损伤部位脊髓正常的灰质/白质结构和神经元功能。本实验结果表明，LPS诱导大鼠ALI后，TNF-α水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），与上述研究报道结果相符。应用PBEF特异性抑制剂FK866腹腔注射干预后，肺组织TNF-α水平明显降低，推测FK866可能通过下调PBEF的基因转录，减低PBEF蛋白表达，从而抑制TNF-α的释放，对ALI产生了保护作用。

IL-1β是具有触发进一步炎性反应的促炎性细胞因子，可以刺激炎性细胞趋化因子的产生，因此被称之为“早期反应细胞因子”[13]。在急性呼吸窘迫综合征发生、发展中，出现明显的炎性反应瀑布样级联反应，其早期外周血、肺及其他组织中的炎性细胞快速释放TNF-α、IL-1β等炎性细胞因子，形成第1次级联释放，释放出的细胞因子作用于肺组织中的肺泡上皮细胞、血管内皮细胞等激发趋化因子等引起第2次级联释放[14]。研究发现，在LPS诱导的肺泡上皮细胞炎性模型中，PBEF升高伴随着NF-κB的激活，继而促进炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-8表达和释放。而在使用PBEF抑制剂FK866后，NF-κB活性降低，炎性细胞因子表达下降[15]。本实验结果表明，LPS诱导大鼠ALI后，肺组织IL-1β的水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），与上述研究报道结果相符。应用PBEF特异性抑制剂FK866腹腔注射干预后，肺组织IL-1β水平明显降低，推测FK866可能通过下调PBEF的基因转录，减低PBEF的蛋白表达，从而抑制了促炎性细胞因子IL-1β的释放，对ALI产生了保护作用。

综上所述，FK866作为一种PBEF的特异性非竞争性抑制剂，可通过抑制肺组织促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β的表达和释放，一定程度上减轻LPS诱导的ALI大鼠肺组织病理损伤程度，对内毒素ALI大鼠肺组织具有一定的保护作用。因此，其在临床脓毒症致ALI的药物治疗中具有潜在的研究价值。