杨勤，杨德全，龚伟（1.重庆三峡医药高等专科学校，重庆404120；2.重庆市抗肿瘤天然药物工程技术研究中心，重庆404120）

狼毒大戟是大戟科狼毒属植物的干燥根，性味辛、平，有大毒[1]。《神农本草经》记载其具有“主咳逆上气，破积聚，饮食，寒热，水气，恶疮，鼠瘘疽蚀，蛊毒”等功效。临床上已有大量报道证明狼毒大戟对肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤有独特疗效，但其抗癌机制尚未明确[2-4]。本研究通过检测狼毒大戟对肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭等方面的影响，探讨狼毒大戟抑制肝癌细胞上皮间质化（EMT）的机制，为进一步研发该药提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人高转移肝癌细胞MHCC97H购于北纳创联。

1.1.2 药物 狼毒大戟采自云南香格里拉，经大理大学张德全副教授鉴定为大戟科狼毒大戟的干燥根。

1.1.3 试剂 DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）购于Hyclone公司。胎牛血清购于Lonsera公司。四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO），Transwell小室、Matrigel胶购于 Corning公司。抗人E-cadherin单抗（ab40772）和抗人Vimentin单抗（ab92547）购于 Abcam公司。β-actin购于 Genetex公司。辣根过氧化物酶标记抗兔免疫球蛋白G（IgG）购于中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人高转移肝癌细胞MHCC97H采用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养基，37℃、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行试验。

1.2.2 狼毒大戟活性部位的提取分离 取干燥狼毒大戟生品200 g，粉碎，过60目筛，用95%乙醇回流提取3次，合并提取液，减压浓缩为浸膏，得狼毒生品的总提取物。用少量水将浸膏分散，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，萃取多次至各有机相无色，合并萃取液，挥干溶剂得各极性部位石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇浸膏。分别称取狼毒大戟提取物1 g，加入DMSO使其完全溶解（体积分数小于0.1%），定容至刻度，制成供试品母液，在超净台内无菌过滤，临用前用培养液稀释成所需质量水平。

1.2.3 MTT法检测狼毒大戟不同提取部位对MHCC97H增殖的影响 试验分为对照组、不同提取部位给药组。对照组是接种细胞但不加入药物，不同提取部位给药组是在各个提取部位不同水平梯度的含药培养液中孵育细胞。取狼毒大戟乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、氯仿等4个提取部位的母液，用培养液配制成以下水平梯度：31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00 μg/mL。取对数生长期的细胞，制成5×105mL−1的单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h细胞贴壁后，吸去培养液，换成含有上述不同水平药物的培养基，每组设5个复孔，置于培养箱中，分别培养24、48、72 h，在培养结束后每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL。继续培养4 h后弃上清液，每孔加入150 μL的DMSO震荡10 min，通过酶标仪在490 nm处检测各孔的吸光度值（A），计算细胞抑制率。

1.2.4 细胞划痕试验 为排除药物细胞毒作用对细胞EMT的影响，后续试验选用乙酸乙酯部位和正丁醇部位的 3 个水平值（125、250、500 μg/mL）作用 24 h后作深入研究，将其作为乙酸乙酯组和正丁醇组。取24孔板，用标记物笔在板底均匀划横线作为标记，每孔加5×105mL−1细胞，细胞贴壁后，用枪头垂直于背后的横线划痕，磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗去掉落的细胞，加入乙酸乙酯组和正丁醇组的稀释液（终水平为125、250、500 μg/mL），用含 1%FBS 的 DMEM 培养，24 h 后镜下拍照，每组取5个视野拍照，测定各划痕在0、24 h的宽度，计算细胞迁移的距离，用愈合率代表愈合能力。

1.2.5 细胞迁移试验 取对数生长期MHCC97H肝癌细胞，用含有1%FBS的DMEM培养液制成单细胞悬液，调整细胞悬液水平为 1×106mL−1，在 Tranwell小室上室中加入乙酸乙酯组和正丁醇组不同水平稀释液的细胞悬液0.1 mL，下室加入0.6 mL含有10%FBS的DMEM培养液，每组种3个复孔，将Transwell小室的24孔板置于37℃培养箱中培养24 h后，取出小室用4%多聚甲醛固定15 min，用0.1%结晶紫溶液染色15 min，用棉签去除上室中残留细胞，置于200×显微镜下，随机选取5个视野，计数每个视野中的细胞数。

1.2.6 细胞侵袭试验 将Transwell小室置于24孔板内，Matrigel胶稀释液均匀铺在Transwell小室底部，每孔100 μL，每组设3个复孔，于37℃培养箱内成胶后取出，细胞接种和药物添加同1.2.5项，培养24 h后，弃去上室液体，用4%多聚甲醛固定15 min，用棉签去除上室中残留细胞，风干后用0.1%结晶紫溶液染色15 min，置于200×显微镜下，随机选取5个视野，计数每个视野中的细胞数，计算平均值。

1.2.7 蛋白质印迹法（Western blotting）检测E-cadherin和Vimentin蛋白表达 不同水平的狼毒大戟乙酸乙酯组和正丁醇组处理MHCC97H肝癌细胞24 h，常规消化细胞后用冰PBS洗涤2次，加入裂解液裂解细胞，离心提取细胞总蛋白。利用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白水平，并根据蛋白提取物水平确定上样量。取蛋白样品进行十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），转膜后，NC膜用封闭液封闭1 h，分别加入一抗 E-cadherin（1∶1 500）、Vimentin（1∶2 500），4 ℃过夜。TBST 洗涤 4次，加入二抗（1∶3 000）室温孵育 1 h，TBST洗涤3次，用ECL化学发光，经凝胶成像仪显影，测定灰度值。以β-actin为内参。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行分析处理。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 狼毒大戟各提取部位对MHCC97H肝癌细胞的增殖抑制作用 分别处理24、48、72 h后，乙酸乙酯组和正丁醇组水平在 31.25～1 000.00 μg/mL时对 MHCC97H细胞的抑制作用呈时间和剂量依赖性，且乙酸乙酯组对细胞的抑制率明显高于正丁醇组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图 1。石油醚部位与氯仿部位对MHCC97H无明显抑制作用。

2.2 狼毒大戟提取部位对MHCC97H细胞划痕愈合率的影响 划痕24 h后，乙酸乙酯组和正丁醇组MHCC97H细胞的迁移距离小于对照组，迁移能力受到明显抑制。正丁醇组在125 μg/mL时愈合率与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；乙酸乙酯组和正丁醇组各水平的愈合率与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。乙酸乙酯组各水平愈合率与正丁醇组两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见图2。

图1 MTT法检测狼毒大戟提取部位对MHCC97H肝癌细胞增殖能力的影响

图2 狼毒大戟提取部位对MHCC97H细胞划痕愈合率的影响

2.3 狼毒大戟各提取部位对MHCC97H肝癌细胞迁移和侵袭的影响 细胞迁移试验显示，培养24 h后，乙酸乙酯组和正丁醇组穿过小室滤膜的迁移细胞数明显低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；乙酸乙酯组和正丁醇组各水平迁移细胞数两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。细胞侵袭试验显示，随着乙酸乙酯和正丁醇水平的增加，穿过基质胶到达小室底端的细胞数量逐渐减少，与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），且具有明显的剂量效应关系。见图3、4。

图3 狼毒大戟各提取部位对MHCC97H细胞迁移的影响

图4 狼毒大戟各提取部位对MHCC97H细胞侵袭的影响

2.4 狼毒大戟提取部位对MHCC97H肝癌细胞中E-cadherin和Vimentin表达的影响 在狼毒大戟提取部位干预后，MHCC97H肝癌细胞中，乙酸乙酯组和正丁醇组的Vimentin蛋白表达水平均明显下调，而E-cadherin的蛋白表达水平均逐渐上调，与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 5、6。

图5 狼毒大戟各提取部位对MHCC97H细胞E-cadherin蛋白相对表达的影响

图6 狼毒大戟各提取部位对MHCC97H细胞Vimentin蛋白相对表达的影响

3 讨 论

肝癌转移是严重影响预后的重要因素[5]。EMT是上皮细胞失去极性，经过细胞骨架重塑转变成具有迁移能力的间充质表型的过程。EMT与肿瘤的发生、发展、侵袭转移等密切相关，是近年来抗肿瘤领域的研究热点之一[6-8]。其中E-cadherin是EMT的特异性标志物之一，其表达水平降低可导致肿瘤细胞间黏附能力减低，迁移能力增强，从而导致肿瘤转移[9]。Vimentin是间质细胞的重要标志物之一，抑制Vimentin的表达可以减弱肿瘤细胞迁移能力[10]。

中医认为，肝癌的病理特点在于肝失疏泄，导致气滞血瘀，气郁化火，日久可成热毒，热毒内蕴，渐成癥瘕，故“以毒攻毒”是中医治疗癌症的重要方法。临床应用有毒中药治疗肿瘤已经取得较好的疗效，从中挖掘提取有效的抗肿瘤药物已成为当前研究的趋势[11-12]。狼毒大戟作为一种有毒的中药，主要含萜类、苯乙酮类、鞣质类、甾醇、挥发油等成分[13]。现代药理研究表明，其有效成分具有抗肿瘤活性[14]。简白羽等[15]报道，狼毒大戟中的没食子酸乙酯体外试验能抑制人结肠癌LOVO细胞、肺癌A549细胞、口腔鳞癌CAL-27细胞的增殖。杨柯等[16]试验表明，狼毒大戟提取液能明显促进人肺癌细胞的凋亡，将细胞周期阻滞在S期，并能明显促进Bax mRNA，抑制Bcl-2mRNA的表达。姜红[17]报道，腹腔注射狼毒大戟提取液，连续7 d，能明显抑制小鼠Lewis肺癌生长，发现其可能通过抑制增殖细胞抗原（PCNA），进而抑制肿瘤细胞的增殖。目前的研究主要围绕狼毒大戟对多种肿瘤细胞增殖的抑制作用，但对肝癌细胞转移和侵袭的作用及机制研究较少。

本研究选择了高转移潜能人肝癌细胞株MHCC97H细胞来检测狼毒大戟对肿瘤细胞迁移、侵袭能力的影响。MTT结果表明，乙酸乙酯和正丁醇部位对肝癌细胞的增殖有抑制作用，且乙酸乙酯提取部位的抑制作用明显强于正丁醇提取部位，证明乙酸乙酯提取部位有明显的抗肿瘤活性。划痕试验和Transwell小室试验结果显示，与对照组比较，乙酸乙酯组和正丁醇组干预后，肝癌细胞的迁移和侵袭能力明显降低，同时检测到标志性蛋白分子E-cadherin表达上调，Vimentin表达下调，提示两者的干预能够抑制肝癌细胞MHCC97H细胞发生EMT。

综上所述，狼毒大戟乙酸乙酯和正丁醇提取部位能够抑制肝癌细胞发生EMT，从而降低肝癌侵袭及远处转移的概率，发挥其抗肿瘤的药性。乙酸乙酯提取部位是狼毒大戟治疗肝癌的重要生物活性成分，值得进一步研究。