王佳贺 王超

[摘要] 目的 探讨自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）和自噬激动剂雷帕霉素（RAPA）对岩大戟内酯B诱导的人白血病细胞系HL-60细胞凋亡的影响。 方法 采用Western blot分析检测不同浓度的岩大戟内酯B作用不同时间后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和自噬调节因子Beclin-1等的表达；将HL-60细胞分为空白对照组、岩大戟内酯B组、岩大戟内酯B联合5 mmol/L 3-MA组、岩大戟内酯B联合10 mmol/L 3-MA组、岩大戟内酯B联合10 nmol/L RAPA组和岩大戟内酯B联合20 nmol/L RAPA组。采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测人白血病细胞系HL-60细胞的凋亡情况；检测Caspase-3蛋白酶的活性。 结果 岩大戟内酯B能够诱导白血病细胞HL-60自噬，增加LC3-Ⅱ和自噬调节因子Beclin-1的表达（P < 0.05）；3-MA可降低岩大戟内酯B诱导的HL-60细胞凋亡和Caspase-3的活性（P < 0.05），而RAPA则提高了岩大戟内酯B诱导的HL-60细胞凋亡率及Caspase-3的活性（P < 0.05）。 结论 岩大戟内酯B可诱导HL-60细胞自噬，细胞自噬在岩大戟内酯B诱导的HL-60细胞凋亡中起到了非常重要的作用。

[关键词] 岩大戟内酯B；白血病；HL-60细胞；细胞凋亡；自噬

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）10（a）-0013-04

Effect of cell autophagy on apoptosis of HL-60 cells induced by Jolkinolide B

WANG Jiahe WANG Chao

Department of Geriatrics， Shengjing Hospital of China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 110004， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of apoptosis of the autophagy-specific inhibitor 3-methyladenine （3-MA） and autophagy agonist rapamycin （RAPA） on the human leukemia cell line HL-60 cells induced by Jolkinolide B. Methods The expressions of autophagy-related protein LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰand autophagy regulator Beclin-1 induced by different doses of Jolkinolide B at different time points were detected by Western blot method. The HL-60 cells were divided into blank control group， Jolkinolide B group， Jolkinolide B combined with 5 mmol/L 3-MA group， Jolkinolide B combined with 10 mmol/L 3-MA group， Jolkinolide B combined with 10 nmol/L RAPA group and Jolkinolide B combined with 20 nmol/L RAPA group. Apoptosis of human leukemia cell line HL-60 cells was detected by Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry. Moreover， the activity of Caspase-3 was detected. Results Jolkinolide B could induce autophagy in leukemia cell line HL-60， increase the expression of LC3-Ⅱ and autophagy regulator Beclin-1 （P < 0.05）. 3-MA could lower the apoptosis rate of HL-60 cells and the activity of Caspase-3 activity induced by Jolkinolide B （P < 0.05）， while RAPA increased the apoptosis rate of HL-60 cells and the activity of Caspase-3 induced by Jolkinolide B （P < 0.05）. Conclusion Jolkinolide B can induce autophagy in HL-60 cells， and autophagy plays an important role in the apoptosis of HL-60 cells induced by Jolkinolide B.

[Key words] Jolkinolide B； Leukemia； HL-60 cell； Apoptosis； Autophagy

白血病是一類造血干细胞恶性克隆性疾病[1]。目前认为细胞自噬广泛参与了白血病的发生[2-3]。中药具有价格低廉、来源丰富等特点，且在干预肿瘤细胞的自噬过程中发挥着重要的作用[4-6]。研究表明[7-9]，从中药狼毒大戟（Euphorbia fischeriana Steud）根部分离的二萜类化合物岩大戟内酯B能够抑制多种白血病细胞增殖，促进白血病细胞凋亡。然而，岩大戟内酯B能否诱导白血病细胞自噬以及自噬与凋亡关系的研究目前鲜有报道。

因此，本研究在前期研究的基础上，通过体外实验探讨岩大戟内酯B是否能够诱导白血病细胞自噬、自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）及自噬激动剂雷帕霉素（RAPA）是否能够影响岩大戟内酯B所致的白血病细胞的凋亡。初步探讨岩大戟内酯B能否诱导HL-60细胞自噬并观察调控自噬对岩大戟内酯B诱导的白血病细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

RPMI 1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司；3-MA和RAPA购自Sigma公司；自噬相关抗体LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、β-actin及其他试剂均为武汉博士德生物工程公司产品；流式细胞仪为美国Backman公司产品；离心机购自德国Eppendorf公司；HL-60细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.2 细胞培养

HL-60细胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，37℃，5%的CO2培养箱中培养。

1.3 Western blot检测白血病细胞HL-60自噬调节蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1的表达

采用岩大戟内酯B分别处理HL-60细胞24、48、72 h或采用浓度分别为0、20、40、80 μg/mL岩大戟内酯B处理HL-60细胞48 h后，常规消化并收集各组细胞，按照总蛋白抽提试剂盒的操作步骤提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白的浓度。等量蛋白用12%的SDS-聚丙烯酰氨凝胶（SDS-PAGE）电泳。在恒定电流下电转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，置于5%脱脂奶粉中，室温封闭2 h。加入1∶1000稀释的一抗，4℃孵育过夜；TBST洗膜3次；加入稀释的二抗，室温孵育1 h；TBST洗膜3次，每次15 min。用抗β-actin抗体标记。按试剂盒说明，采用发光试剂浸润PVDF膜，胶片在感光屏内曝光成像后，结果在凝胶成相仪上照相。本实验重复3次。

1.4 岩大戟内酯B作用于HL-60细胞分组

将HL-60细胞分为空白对照组、岩大戟内酯B组、岩大戟内酯B联合5 mmol/L 3-MA组、岩大戟内酯B联合10 mmol/L 3-MA组、岩大戟内酯B联合10 nmol/L RAPA组和岩大戟内酯B联合20 nmol/L RAPA组，分别培养24 h。

1.5 流式细胞仪检测HL-60细胞的凋亡率

取对数生长期的HL-60细胞，分为空白对照组、岩大戟内酯B组、岩大戟内酯B联合5 mmol/L 3-MA组、岩大戟内酯B联合10 mmol/L 3-MA组、岩大戟内酯B联合10 nmol/L RAPA组和岩大戟内酯B联合20 nmol/L RAPA组。岩大戟内酯B、岩大戟内酯B联合不同浓度的3-MA和岩大戟内酯B联合不同浓度的RAPA分别处理24 h后收集HL-60细胞，将细胞悬于300 μL的Binding Buffer，依次加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的碘化丙啶（PI），轻轻混匀，避光，室温反应15 min，流式细胞仪检测各组HL-60细胞的凋亡率。

1.6 Caspase-3活性测定

岩大戟内酯B、岩大戟内酯B联合不同浓度的3-MA和岩大戟内酯B联合不同浓度的RAPA分别处理HL-60细胞24 h后，比色法检测Caspase-3的活性。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 岩大戟内酯B对LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白表达的影响

岩大戟内酯B分别处理HL-60细胞24、48、72 h后或不同浓度的岩大戟内酯B分别处理HL-60细胞48 h后，细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ增大，Beclin-1蛋白表达亦逐渐增加。Beclin-1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白表达的电泳结果见图1。

2.2 流式细胞仪分析HL-60细胞的凋亡率

岩大戟内酯B组HL-60细胞的凋亡率与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；与岩大戟内酯B组比较，巖大戟内酯B联合5 mmol/L 3-MA组及岩大戟内酯B联合10 mmol/L 3-MA组的HL-60细胞凋亡率均下降，而岩大戟内酯B联合10 nmol/L RAPA组和岩大戟内酯B联合20 nmol/L RAPA组的HL-60细胞凋亡率均增加，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

1：空白对照组；2：岩大戟内酯B组；3：岩大戟内酯B联合5 mmol/L 3-MA组；4：岩大戟内酯B联合10 mmol/L 3-MA组；5：岩大戟内酯B联合10 nmol/L RAPA组；6：岩大戟内酯B联合20 nmol/L RAPA组。与空白对照组比较，#P < 0.05；与岩大戟内酯B组比较，*P < 0.05

图2 不同处理组白血病细胞HL-60的凋亡率

2.3 Caspase-3活性

岩大戟内酯B组的HL-60细胞Caspase-3活性与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；与岩大戟内酯B组比较，岩大戟内酯B联合5 mmol/L 3-MA组和岩大戟内酯B联合10 mmol/L 3-MA组的HL-60细胞Caspase-3活性均下降，岩大戟内酯B联合10 nmol/L RAPA组和岩大戟内酯B联合20 nmol/L RAPA组的HL-60细胞Caspase-3活性均增加，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图3。

1：空白对照组；2：岩大戟内酯B组；3：岩大戟内酯B联合5 mmol/L 3-MA组；4：岩大戟内酯B联合10 mmol/L 3-MA组；5：岩大戟内酯B联合10 nmol/L RAPA组；6：岩大戟内酯B联合20 nmol/L RAPA组。与空白对照组比较，#P < 0.05；与岩大戟内酯B组比较，*P < 0.05

圖3 不同处理组白血病细胞HL-60的Caspase-3活性

3 讨论

大量研究表明[10-11]，抗肿瘤药物的作用机制之一是调节肿瘤细胞自噬的发生。自噬是一种细胞程序性死亡方式。不同种类药物作用于白血病患者的效果会因自噬效应的不同而有所差别。LC3是重要的自噬标记分子[12]。LC3主要包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种存在形式。LC3前体形成后，首先被加工成LC3-Ⅰ，其为胞质可溶性形式，被Atg7活化；后者再经过修饰生成LC3-Ⅱ，其为膜结合形式，并且定位于自噬前体和自噬体，最后被水解酶水解。LC3-Ⅱ含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在一定程度上与自噬体数量成正比，并反映了自噬活性[13]。Beclin-1亦是参与自噬调控的重要基因，是哺乳动物与酵母自噬相关基因Atg6/Vps30同源的基因，其表达强度与自噬活性密切相关[14-16]。本研究发现，采用岩大戟内酯B处理HL-60细胞，细胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达随着大戟内酯B浓度的增加及作用时间的延长均增强，进一步说明LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白参与了岩大戟内酯B诱导的HL-60的自噬性细胞死亡。因此，靶向调控自噬性细胞死亡途径可能成为治疗白血病的新方法之一。

此外，自噬在肿瘤的发生发展中具有双重作用，即某些情况下能够抑制细胞凋亡，而在某些情况下又能促进细胞发生凋亡[17-18]。为了探讨岩大戟内酯B诱导的HL-60细胞自噬与细胞凋亡的相关性，本研究分别联用自噬抑制剂3-MA和自噬激动剂RAPA，观察自噬对岩大戟内酯B诱导的HL-60细胞凋亡的影响。本结果显示，HL-60细胞经3-MA预处理后，岩大戟内酯B诱导的HL-60细胞凋亡率降低；HL-60细胞经自噬激动剂RAPA预处理后，岩大戟内酯B诱导的HL-60细胞凋亡率增加。提示抑制岩大戟内酯B诱导的自噬能够抑制HL-60细胞凋亡，岩大戟内酯B与自噬激动剂RAPA的联合应用可能为白血病的临床治疗提供新策略。

细胞自噬和凋亡的信号通路中存在着众多的交叉，白血病细胞自噬和凋亡的具体关系仍不十分清楚[19-20]。促进或抑制细胞自噬，进而提高白血病的化疗效果，可能成为未来白血病治疗的策略之一。继续深入探讨岩大戟内酯B诱导的白血病细胞自噬和凋亡的关系以及各相关信号转导通路在细胞自噬和凋亡过程中的作用，以便为通过促进或抑制细胞自噬的发生治疗白血病提供一定的理论依据。

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（收稿日期：2017-11-07 本文编辑：任 念）