冀秀敏,潘 暕,周 嘉

(复旦大学 专用集成电路与系统国家重点实验室,上海 200433)

片上实验室(Lab-on-chip, LOC)旨在开发一个集成有多种功能的平台.该平台主要应用于化学或生物的分析,其中微粒或细胞的分选是基本功能之一.目前已经有多种技术被应用于微粒分选中.传统的微粒/细胞分选技术,如荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated Cell Sorting, FACS)[1]和磁激活细胞分选(Magnetic-activated Cell Sorting, MACS)[2],具有高的分选效率,但同时也需要昂贵的设备、专业的操作人员以及特殊处理的样本,因此不符合便携式与实时监测的要求.微流体分选技术所需样本量少,操作简单,因此得到了广泛的关注.介电泳(Dielectrophoresis, DEP)具有主动、无创伤、无标记分选的优势,它依据微粒的物理特性,如形状与尺寸,流体与微粒的电场特性以及外加非均匀电场的强度与频率等都可以实现分选[3],因而得到广泛的研究和关注.除了可极化的微粒,介电泳技术还可以用于聚苯乙烯微粒[4]、细胞[5]、脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid, DNA)[6]、蛋白质[7]、细菌[8]等物质的操控.目前介电泳芯片已经成功应用于微粒或细胞的分选[9]、吸附[10]、分离[11]、富集[12]及运输[13]等.

介电泳芯片由电极和微流道组成,由于非均匀电场主要由电极的结构、位置决定,因此电极设计对于实现微粒的分选至关重要.在过去的十几年中,介电泳电极经历了从二维结构到三维结构的变迁.二维电极,如平面电极[14],通常位于微流道的底部,在微流道的高度方向上形成垂直的非均匀电场.由于电场随着与电极表面的距离的增加呈指数性衰减,在远离电极表面的区域的微粒将可能不会受到介电泳力的作用,形成驱动“死区”,因此平面电极的介电泳芯片限制了微流道的高度尺寸,通量较小.为解决微粒驱动“死区”的问题,三维电极渐渐成为研究热点,如双平面电极[15]、碳化的环氧基紫外负性光刻胶电极[16]、电镀的金属电极[17]、重掺杂的硅电极[18]、银浆掺杂的聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS)电极[19]等.三维电极与微流道的高度相同,在微流道的每个高度形成相同的非均匀电场的分布,对于实现高通量的微粒分选提供了可能性.然而,目前所报道的三维电极通常位于微流道内部或者侧壁,与流体直接接触.因此,流体对电极的玷污以及电极表面强电场对生物样本活性的损伤是不可避免的[20-21].

本文提出与集成电路(Integrated Circuit, IC)工艺兼容的三维电极的介电泳芯片模型,芯片中的电极与流体完全隔离.在COMSOL软件中建立该模型,模拟了介电泳芯片在外加交变电场时的微粒分选效果,并在实验中验证了芯片在外加交变电场时微粒分选功能.

1 模型与原理

1.1 芯片模型

介电泳芯片由微流道和三维电极阵列组成,电极结构及微流道的尺寸如图1所示.微流道结构中包括1个微粒入口Inlet 2, 1个缓冲液入口Inlet 1,以及2个出口Outlet 1/Outlet 2.微流道侧壁附近排列有30个铜电极,电极与微流道之间通过30μm的硅间隙完全隔离,避免了流体对电极的污染.

图1 介电泳芯片模型Fig.1 DEP chip model

缓冲液从Inlet 1中注入,推动微粒沿着靠近电极的微流道一侧运动.未加电场时,微粒溶液从Outlet 2中流出.当外加直流电场或者交变电场时,大粒子在负介电泳力的作用下从Outlet 1中流出,小粒子则仍从Outlet 2中流出,因此本文主要关注的是大粒子在负介电泳力作用下的运动情况.在之后的仿真以及实验中,我们选取直径为10μm的微粒作为研究对象.

1.2 理论背景

微粒所受的介电泳力的大小和性质与多种参数有关.对于半径为r球型的微粒,微粒所受的介电泳力为：

(1)

其中：εm是缓冲液的介电常数；是外加电场电平有效值平方的梯度；Erms是外加电场电平E的有效值,是克劳修斯莫索夫(Clausius-Mossotti, CM)因子,其中ω=2πf,f是外加电场的频率.CM因子是微粒和缓冲液的复介电常数的函数,CM因子的表达式为：

(2)

其中复介电常数ε*=ε-iσ/ω，ε为介电常数,σ是电导率.

2 模型仿真

介电泳的微粒分选是多种物理场共同作用的结果,如流体力学、电场等.在COMSOL仿真软件中建立芯片模型,并利用其中的多物理场模型对芯片的微粒分选性能进行了有限元仿真.在COMSOL仿真软件中,我们使用的多物理场有层流模块(Laminar Flow),电流模型(Electric Currents)以及粒子追踪模块(Particle Tracing).在芯片电极上施加交变电场信号,模拟了交流介电泳(Alternating Current Dielectrophoresis, AC-DEP)对10μm微粒的分选性能.

交变电场常被应用于介电泳芯片中非均匀电场的产生.表1为AC-DEP对10μm微粒分选的仿真结果.由表1(见第464页)可知,微粒所受介电泳力大小,不仅与流体电导率、流速、电场强度平方梯度有关,还与交变电场的频率有关.在AC-DEP中,临界分选电压仅在十伏量级,最大电场平方梯度在1015V2/m3以上.当微粒与缓冲液的流速均为1μL/min,流体电导率为18μS/cm时,微粒的临界分选电压为15V.

介电泳力随交变电场频率的变化称为频率特性,主要由CM因子体现.当CM因子的实数部为负数时,表示微粒受到负介电泳力作用；若CM因子的实数部为正数,则微粒受到正介电泳力作用.图2为0～3MHz范围内CM因子实数部的变化曲线.在0～3MHz范围内CM因子的实数部始终为负数,因此10μm微粒受到负介电泳力的作用.

表1 AC-DEP仿真结果

图3为当微粒与缓冲液的流速均为1μL/min,流体电导率为18μS/cm,外加电平有效值为20Vrms的不同频率的交变电场时,10μm微粒在负介电泳力的作用下的运动轨迹.图中横纵坐标分别代表模型的长度和宽度.入口和出口分别位于X>2000μm和X<-2000μm的位置处.出口Outlet 1/Outlet 2以及入口Inlet 1/Inlet 2分别标识于坐标轴上.由图3可知,当频率小于100kHz时,微粒的运动轨迹重叠,说明当外加交变电场的频率小于100kHz时,10μm微粒所受介电泳作用相同；当频率大于100kHz时,随频率的增加,微粒的运动轨迹向Outlet 2靠近,即微粒所受负介电泳作用降低.且只有当频率小于2MHz时,全部的10μm微粒从Outlet 1中流出.因此,本芯片中的有效微粒分选频率应该位于0.1～2MHz之间.

图2 电场频率对CM因子的影响Fig.2 Effect of electric field frequency on CM factor

图3 10μm微粒在不同频率的交变电场作用下的运动轨迹率Fig.3 10μm particle trajectories varying with frequency under AC

3 实验验证

图4 制备完成的介电泳芯片Fig.4 The fabricated DEP chip

利用集成电路工艺制备完成了硅衬底的介电泳芯片.具体的工艺流程为： 通过光刻和深槽刻蚀在硅衬底上刻蚀出三维电极槽.之后,在电极槽中淀积铜金属薄膜,其功能等效于三维电极的立体结构.再次光刻以及刻蚀出与电极槽相同深度的微流道.最后将硅衬底结构与聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS)键合,完成芯片的制备.介电泳芯片与定制的印刷电路板(Printed Circuit Board, PCB)封装,可用于测试的介电泳芯片如图4所示.介电泳芯片中包含30个电极,相邻电极为一组,形成两级加电模式.

3.1 样本处理

实验中选取飞世尔公司9.9μm的聚苯乙烯微粒(G1000, Thermo Scientific., USA)为研究对象.并由去离子水和抗胶凝助剂(Tween 20, Aesar., China)调制出电导率为18μS/cm的缓冲液.将聚苯乙烯微粒原液加入缓冲液中构成微粒溶液.在测试之前,缓冲液和微粒溶液都需要在超声仪中超声5min,以保证缓冲液和微粒溶液中的各相混合均匀.

3.2 测试系统

将制备完成的芯片置于显微镜(307-143003, ERNST LEITZ WETZLAR GMBH., Germany)的载物台上,并通过安装于显微镜上的数字电荷耦合器件(Charge Coupled Device, CCD)摄像机监测微粒的运动.微粒溶液和缓冲液由注射泵(KDS 210P/KDS Legato 200, KD Scientific., USA)注入微流道入口.函数信号发生器(DG4162, RIGOL., China)用于在芯片上施加交变电场,电压放大器(2340, TEGAM., USA)可以放大交变电场的电压值.至此,介电泳微粒分选的测试系统搭建完成.

3.3 测试结果

图5为当微粒与缓冲液的流速均为1μL/min,流体电导率为18μS/cm时,100kHz的不同电平的交变电压下的9.9μm微粒运动轨迹.零电平时,微粒从Outlet 2中流出；随着电平的增加,微粒的运动轨迹向Outlet 1偏移；当电平有效值为20Vrms时,大部分的9.9μm微粒从Outlet 1中流出,此时微粒的分选效率为72.6%.

图5 9.9μm聚苯乙烯微粒在流体流速为1μL/min,流体电导率为18μS/cm,不同电平有效值的100kHz的交变电场下的运动轨迹Fig.5 9.9μm green fluorescent particle trajectories varying with AC voltage, when velocity of particle solution and buffer solution is 1μL/min, buffer solution conductivity is 18μS/cm, the frequency is 100kHz

与仿真结果相比,测试中的微粒分选电压上升,产生该问题的主要原因是COMSOL软件中的芯片模型为简化模型,而实验中的硅衬底则具有一定的掺杂浓度,介电常数降低,同时制备的三维电极中存在缺陷.综上所述,实验中的微粒分选电压要大于仿真中的电压值.

4 结 语

本文提出了集成有与流体完全隔离的三维电极的介电泳芯片模型.首先在COMSOL仿真软件中对芯片外加交变电场时的10μm微粒的分选性能进行了仿真研究.之后利用集成电路工艺完成了芯片的制备,并将其用于微粒的实际分选测试中.当外加100kHz, 20Vrms的交变电场时,72.6%的9.9μm微粒从Outlet 1中流出,完成分选.