王慧桥，陈为峰，诸葛玉平，胡国庆，于海燕，付乃鑫，董元杰

(山东农业大学 资源与环境学院，土肥资源高效利用国家工程实验室，山东 泰安 271018)

在农业生产中，氮是衡量土地养分状况及土壤肥力的一个重要指标。近年来，大量施用化肥尤其是氮肥，造成土壤质量退化等一系列负面问题，使得绿色环保的微生物肥料逐渐受到人们的青睐[1-2]。自生固氮微生物在农业生产中有巨大的应用潜力，可通过生物固氮为小麦、玉米等多种农作物提供氮素养分[3-9]。蒋宝贵等[10]从华中农业大学试验田土壤中，筛选得到一株假单胞菌。张燕春等[11]从河北省高碑店土壤中选育到一株耐盐、耐低温的高效固氮芽孢菌 GD272，将其接种到小白菜盆栽中，对小白菜的促生效果达到了化学肥料处理水平。张巍等[12]从松嫩平原的盐碱土中分离筛选出FC5和FC10这2株耐盐碱性较好的固氮菌，同属于固氮菌属。然而，由于固氮菌对土壤环境要求严苛等缺点，目前有关滨海盐土自生固氮菌的筛选及应用等相关研究仍较少。

自生固氮菌除固氮促进植物生长外，其代谢产生的植物激素、维生素以及酸性物质都可以不同程度刺激、调节植物生长，其中较常见的是生长素(IAA)。目前，研究较为深入的是有关根际促生细菌产生IAA的作用及机制，揭示了IAA不仅具有直接促生作用，同时可使色氨酸类似物解毒，减轻其毒害作用。细菌分泌IAA的动态变化、IAA含量的稳定性研究为确定微生物菌肥用量及施肥时间提供理论依据[13]。固氮菌发挥固氮作用的前提是保证菌体正常生长，但固氮菌所需要的最适环境不一定是固氮作用的最佳条件。

滨海盐土作为一种重要类型的盐渍土，土表积盐严重，过多的盐分引起一系列土地质量退化问题，直接影响作物的生长[14]。新开垦的盐碱农田肥力低下，有效氮含量低，对山东省滨州地区盐土理化性质的初步研究发现，研究区域有效氮含量低于45 mg/kg，增施固氮菌肥有很好的增氮抗盐碱作用[15-17]。而近年来黄河三角洲的中低产盐碱农田也存在氮肥施用过量，加重土壤盐渍化，并引起面源污染和农产品安全问题。

本研究是在筛选自生固氮菌株的前提下，通过形态特征观察、生理生化测定和16S rDNA基因测序的研究方法对筛选得到的2株高效自生固氮菌进行鉴定，并对其环境适应性，以及对盆栽小麦的促生效应进行了研究，以期为生产盐碱地专用固氮菌肥提供理论依据和技术支撑，研究结果既有利于新开垦盐碱农田的地力提升，又有利于中低产盐碱田调整施肥结构，同时也有利于适度减少氮肥施用量，保护环境，改善农产品品质。

1 材料和方法

1.1 自生固氮菌的筛选

菌株筛选在土肥资源高效利用国家工程实验室进行。

供试土壤采自山东省无棣县渤海粮仓试验示范基地，土壤类型是滨海盐土。将土壤制成3个稀释度(10-4，10-5，10-6)的稀释液，涂布在Ashby无氮固体培养皿上，28 ℃培养4 d。

4 d后，统计培养皿中固氮菌的菌落数量，仔细观察培养基上的菌落形态，镜检进行确认。挑取生长较大及不同形态的菌落划线纯化数次，至有规则单菌落出现。选取2种长势最优的自生固氮菌株，编号为菌株1和菌株2。然后，将单菌落接种到斜面培养基，直至菌落长起，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2 自生固氮菌初步鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》[18]和《微生物学实验技术》[19]对2株菌进行形态学分析、生理生化测定。

细菌16S rDNA基因片段扩增参考王慧桥等[20]的方法，序列测定由北京六合华大基因科技有限公司完成，将获得的序列结果在GenBank数据库中比对，Blast搜索同源序列，MEGA 7.0软件构建系统发育树。

固氮酶活性参考姜瑛等[21]的方法，乙炔还原活性(ARA)计算公式如下。

ARA(C2H4)(μmol/(h·mL))=(实际C2H4峰面积×标准气含量×青霉素瓶容积)/(标准气峰面积×进样量×培养时间×样品量)。

1.3 环境因子对菌株1和菌株2分泌IAA的影响

1.3.1 试验设计 酸碱度试验：基础培养基的起始pH值设为4，5，6，7，8，9，10，11共8个水平；碳源适应性试验：基础培养基中的碳源分别用等量的草酸、柠檬酸、苹果酸、甘露醇、蔗糖、葡萄糖替代；铵浓度试验：基础培养基中加入硫酸铵使培养液NH4+浓度达0，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mmol/L共8个水平；渗透压试验：基础培养基的NaCl浓度设0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，5.0%，15.0%共6个水平。

1.3.2 IAA 分泌量的测定 将不同培养条件下的菌液分别接种于含有 L-色氨酸(200 mg/L)的 LB 液体培养基中，28 ℃，180 r/min摇床中培养。48 h后取一定量的菌液于10 000 r/min下离心 10 min，取1 mL上清液加入等体积Salkowski 比色液，混匀避光静置30 min，测定其 OD530值。计算发酵液中 IAA 的含量(μg/mL)。

1.4 小麦盆栽接种试验

1.4.1 试验设计 盆栽用土取自山东农业大学南校区资环试验站。表1为供试土壤的基本理化性质。供试作物为小麦(山农22)。

试验设3个处理，处理一：CK(对照，不施肥)；处理二：T1(菌1)；处理三：T2(菌2)，每个处理重复6次。每盆装土2.5 kg，每盆播种30粒，留苗20株。菌剂接种量100 mL/盆，接种浓度107cfu/mL，CK处理浇灌培养基100 mL/盆。为避免滨海盐土相似土著微生物的影响，盆栽供试土壤为异地土壤，对盆栽土壤人工盐化，控制土壤含盐量为2‰。于2017年3月1日在山东农业大学南校区资环试验站进行，常规管理。生长50 d后取样计算生物量，考察促生效果。

表1 供试土壤基本理化性质Tab.1 Main characteristics of experimental soil

1.4.2 测定项目与分析方法 植株氮、磷、钾含量测定：将植株样品烘干研磨过筛，用H2SO4-H2O2消化，采用凯氏定氮法测定全氮含量，钼锑抗比色法测定全磷含量，火焰光度计测定全钾含量[22]。

土壤指标测定：土壤有效氮用碱解扩散法测定，土壤速效磷用0.5 mol/L碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定，土壤速效钾用1 mol/L乙酸铵提取-火焰光度法测定[22]。土壤脲酶活性采用比色法[23]测定。

1.5 数据分析

采用Excel 2003软件处理数据并绘表，采用SPSS 19.0软件进行方差分析，最小显著极差法(LSD)进行差异显著性检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 自生固氮菌菌株1和菌株2鉴定

将利用Ashby无氮培养基筛选到的2株典型自生固氮菌菌株1和菌株2作为供试菌株进行研究。平板培养结果显示，菌株1菌落呈乳黄色，菌落大小1～2 mm，褶皱，扁平，湿润有光泽，边缘不整齐；菌株2为圆形、无色透明、有光泽、隆起菌落，菌落大小1.0～1.4 mm，边缘整齐，晶莹透明。显微镜下显示，菌株1和菌株2均为短杆菌，大小分别为2.64～1.32×1.01～0.73 μm，3.46～1.93×0.80～0.84 μm。菌体染色表明，2株菌均为革兰氏阴性细菌。2株菌的生理生化特征见表2。其中，菌株1脲酶反应强烈，分解尿素能力较强；能利用丙二酸盐作为唯一碳源；具运动性，属好氧性细菌。菌株2可分解尿素，具脲酶；可利用丙二酸盐；产过氧化氢酶；具运动性，严格需氧性细菌。

表2 固氮菌的生理生化特性Tab.2 physiological and biochemical characteristics of strains

注：+.阳性反应；-.阴性反应。
Note：+. Positive；-.Negative.

进一步通过分子生物学方法鉴定菌株，以菌株1和菌株2的基因组DNA作模板，用细菌通用引物进行PCR扩增，分别得到长度为1 333，1 352 bp的扩增产物。将测序结果在GenBank数据库中与已有细菌的16S rDNA核苷酸序列进行比对。菌株1与贪噬菌属细菌16S rDNA基因序列的相似性均在99%以上，菌株2与固氮螺菌属细菌的16S rDNA基因序列达到98%相似性。根据序列在NCBI数据库中Blast的结果，将这些序列进行分析，采用MEGA 7.0软件建立1、2菌株系统发育树(图1)。结果显示，菌株1与争论贪噬菌同源性最高，菌株2与玉米固氮螺菌同源性最高。参考形态学分析、生理生化特征鉴定结果，菌株1鉴定为争论贪噬菌(Variovoraxparadoxus)，菌株2为玉米固氮螺菌(Azospirillumzeae)。用乙炔还原法测定菌1和菌2固氮酶的活性，结果表明，菌株1和菌株2的固氮酶活性分别为 4.71，2.84 μmol/(h·mL)，证明这2株菌均为具有高效酶活的菌株。

图1 菌株16S rDNA基因序列系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of strains based on 16S rDNA gene sequences

2.2 环境因子对菌株1和菌株2分泌IAA的影响

在不同pH培养条件下，测得2株菌IAA分泌量(图2-A)。由图2-A可见当培养液pH值为4～10，菌株1 IAA分泌量随pH值增大有增加趋势。当培养液pH值为10，菌株1 IAA分泌量为13.72 μg/mL，显著高于其他pH值处理。虽然在极端环境下，菌株1分泌IAA量较低，但也间接说明其可以通过分泌一些代谢产物来维持自身生长，说明该菌对酸碱适应性较强。菌株2在各pH值环境下IAA分泌量为8.10～12.77 μg/mL，培养液pH 值8条件下IAA分泌量12.77 μg/mL，显著高于其他pH值处理。菌株2在不同pH条件下IAA分泌能力均没有受到强烈的抑制作用，说明该菌对酸碱适应性较强。不同pH的培养液对2株菌的作用不同。

不同字母表示差异显著(P<0.05)。图3同。Different letters mean significant difference at 0.05 level. The same as Fig.3.

NaCl是细菌生长的一个重要因子。2株菌在相同的渗透压梯度，分泌IAA能力表现具有同一性(图2-B)。由图2-B可见，当NaCl浓度为0.5% 时，菌株1和菌株2的IAA分泌量最大，分别为9.85，5.38 μg/mL。当NaCl浓度为0.5%～1.0%时，2株菌IAA分泌量急剧下降，菌1和菌2分别降低64.2%，57.8%。当NaCl浓度为1.0%～5.0%时，菌1和菌2的IAA分泌量分别为2.01～4.96 μg/mL，0.75～2.77 μg/mL。当NaCl浓度为15% 时，2株菌分泌IAA能力被完全抑制。

菌株1和菌株2在含糖及有机酸为碳源的培养基中均能分泌IAA。由图3-A可见，在单一碳源利用方面，菌1产IAA能力分别为甘露醇>蔗糖>葡萄糖>草酸>柠檬酸>苹果酸，当碳源为甘露醇、蔗糖和葡萄糖时，IAA含量高达7.45～5.93 μg/mL，不同碳源处理间差存在差异。菌株2对碳源利用表现为葡萄糖>草酸>苹果酸>蔗糖>柠檬酸>甘露醇，IAA分泌量为1.51～3.15 μg/mL。2株菌在碳源利用方面表现不同，表明不同属的固氮菌对碳源的利用存在差异。

在基础培养基中，通过外源添加不同浓度(NH4)2SO4，探究氮源对菌株分泌IAA的作用。如图3-B所示，当NH4+浓度为0.5 mmol/L，菌株1 IAA分泌量较对照(不添加NH4+增加31.2%。当继续增加NH4+浓度，IAA分泌量受到不同程度地抑制，当NH4+浓度为1.0 mmol/L，较对照降低24.5%，该浓度下NH4+对菌1的IAA分泌量抑制作用最明显。菌株 2 对 NH4+利用呈 M 型曲线，当NH4+浓度为1.0，4.0 mmol/L，菌株2分泌IAA含量较对照分别增加了10.4%，20.5%，较对照差异不显著。当NH4+浓度为8.0 mmol/L，对菌株2的IAA分泌量抑制作用最强，较对照降低25.6%。

图3不同碳源、NH4+浓度对菌株分泌IAA能力的影响Fig.3 Effect of carbon sources and NH4+onIAA producing ability of two strains

2.3 菌株1和菌株2对盆栽小麦生长的影响

2.3.1 菌株1和菌株2对小麦幼苗生长的影响 与CK相比，菌株1(T1)和菌株(T2)对小麦的生长起到促进作用，鲜质量与干质量明显增加(表3)。相对于CK，T1、T2株高显著增加了26.76%，29.83%；地上部鲜质量增加了15.80%，51.35%，干质量增加了28.57%，66.23%；地下部鲜质量增加了63.67%，32.81%，干质量增加了135.71%，25.00%；叶绿素含量分别增加了11.24%，29.21%。说明菌株1和菌株2均能够提高小麦幼苗的光合作用，从而促进小麦生长，以菌株2效果较好。

表3 菌株对小麦叶绿素含量及幼苗生长的影响Tab.3 Effects of strains on chlorophyll contents in leaves and growth of wheat seedlings

注：同一列中的不同字母表示差异显著(P<0.05)。表4-5同。
Note：Different letters in the same column mean significant difference at 0.05 level. The same as Tab.4-5.

2.3.2 菌株1和菌株2对小麦幼苗N、P、K积累量的影响 添加菌剂均不同程度地提高了小麦幼苗养分含量(表4)。与CK相比，菌株1和菌株2处理地上部小麦氮含量增加了15.33%，21.60%；小麦地下部氮含量增加了60.20%，50.00%。菌株1和菌株2均显著地促进了小麦幼苗对磷、钾的吸收。与CK相比，菌株1和菌株2地上部、地下部小麦磷含量分别增加了14.98%，38.44%，42.34%，69.30%；钾含量分别增加了20.2%，22.85%，49.96%，84.22%。菌株2对小麦地上部氮含量的促进作用略优于菌株1但没有达到显著水平。

2.3.3 菌株1和菌株2对土壤养分含量及脲酶活性的影响 施用菌株1和菌株2显著提高土壤速效养分含量(表5)。与CK相比，速效氮含量分别提高了12.94%，41.53%；速效磷含量分别增加了38.37%，41.47%；速效钾含量提高了16.60%，34.33%。这说明自生固氮菌菌株1和菌株2促进了土壤中一些被固定的氮、磷及缓效钾的释放及分解，保证小麦生长需求。

脲酶在土壤氮素循环中发挥着关键作用，一般以酶有机质复合体存在土壤中，可以促进尿素水解成氨、CO2，进而促进植株对氮素的吸收。如表5，菌株1和菌株2土壤中脲酶含量显著增加了16.00%，48.15%。添加菌剂显著提高了土壤中脲酶的含量，菌株2显著优于菌株1。

表4 菌株1和菌株2对小麦幼苗N、P、K积累量的影响Tab.4 Effects of strain 1，strain 2 on N，P，K contents of wheat seedlings mg/g

表5 菌株1和菌株2对土壤有效氮、速效磷、速效钾及土壤脲酶活性的影响Tab.5 Effects of strain 1，strain2 on available N，available P，available K and soil urease enzymatic activity

3 讨论与结论

本研究对从滨海盐土中筛选得到的2株自生固氮菌，经形态学及分子生物学鉴定，确定菌株1为争论贪噬菌(Variovoraxparadoxus)，菌株2为玉米固氮螺菌(Azospirillumzeae)。筛选到的菌株1、2固氮酶活性分别为4.71，2.84 μmol/(h·mL)，这与已报道的高效固氮菌固氮能力相当[5，24]，属于高效固氮菌株。

环境因素及培养液中的添加物的化学特性等，都能显著影响自生固氮菌的生长及分泌IAA的能力。本试验从黄河三角洲滨海盐土作物根际土中分离到的2株菌对pH 值、渗透压、碳源、氮源的要求及表现也不同。一般的固氮菌适宜生长pH值范围在 5～8[25]。试验发现，菌株1在pH值4～11时均可以分泌IAA，在碱性环境下仍具有较高的IAA分泌能力；菌株2在该pH范围内分泌IAA含量较稳定，对酸碱环境适应能力较强。2株菌IAA分泌量随培养液中NaCl浓度增加而降低。当NaCl浓度低于5%时，2株菌分泌IAA能力较强。当NaCl浓度超过5% 时，2株菌IAA分泌能力显著下降直至缺失。不同固氮菌对碳源和营养元素要求不同。姚拓等[26]对从小麦根际分离的固氮菌的研究指出，菌最好的碳源为蔗糖。菌株1对蔗糖和甘露醇利用较好；菌株2在葡萄糖和草酸的培养基中IAA分泌量高于其他碳源。外源添加NH4+可以不同程度提高菌株IAA的分泌能力。菌株1和菌株2对NH4+敏感度表现不同。不同菌株对NH4+氮素需求有一定的差异。同一菌株当 NH4+添加量不同，IAA分泌能力也不同。事实上，固氮菌对铵盐的利用要大于对氮气的利用，因而，当生长环境中存在大量铵盐时，会抑制固氮菌的固氮作用及分泌IAA能力，从而降低其固氮效率。

小麦盆栽试验结果表明，虽然菌株1的固氮酶活性较高，但小麦促生效果低于菌株2，这表明菌株固氮酶活性高低与小麦生长参数关系并不密切，可能由于固氮菌株1和菌株2对生长环境适应性不同导致，也进一步说明了自生固氮菌的应用及其固氮作用的发挥与环境条件有紧密关系[13]。在植物营养代谢中氮发挥着重要作用，不仅是植物体蛋白质、核酸、叶绿素以及酶的组成成分，还是众多内源激素的组分。由于氮主要分布在分生组织、叶片及其他生命旺盛的部位，所以氮对植物意义重大。菌株1和菌株2显著增加了土壤中速效氮的供应，进而提高小麦植株地上部、地下部对氮素的吸收。固氮能力较强的优质固氮菌还能活化土壤中磷与钾、分泌生长素，促进作物生长，抑制作物病害等，表现出较高的生态效益与经济效益[27]。菌株1和菌株2活化了土壤中难溶性磷与缓效性钾，显著增加了土壤中有效磷、速效钾含量，小麦植株表现为株高增长、干质量和鲜质量增加，对其生长起到了积极的促生作用。

土壤酶是土壤物质能量循环中的重要分支，其中脲酶与土壤中固氮微生物共同参与土壤代谢过程，被认为是最敏感、最具潜力的土壤质量生物学指标之一[23]。脲酶的酶促反应产物氨是植物重要的氮素来源，其活性强弱在一定程度上可以表征土壤氮素及肥力状况。菌株1和菌株2能显著提高土壤中的脲酶活性，这可能是由于自生固氮菌分泌的一些激素，溶解或水解了土壤中的有机质，从而提高了水溶性有机质含量，因而脲酶活性也随之增加。

通过生理生化及分子生物学手段，从滨海盐土中筛选到的自生固氮菌1为争论贪噬菌(Variovoraxparadoxus)，菌2为玉米固氮螺菌(Azospirillumzeae)。筛选到的菌株1、2固氮酶活性较高，分别为4.71，2.84 μmol/(h·mL)。环境适应性试验表明，菌株1和菌株2在酸碱环境下仍保持较高的IAA分泌量；当NaCl浓度低于5%时，IAA分泌能力较强；对碳源及NH4+利用表现不同。盆栽试验下，菌株1和菌株2处理显著提高了小麦生物量及小麦植株N、P、K含量，增加了土壤中速效养分含量，增强了土壤脲酶活性，菌株2处理效果显著优于菌株1。