杨一舟 李魏 易图永 李峰

（1. 湖南农业大学植物保护学院，长沙 410128；2. 华中农业大学园艺林学学院 园艺植物生物学（教育部）重点实验室，武汉 430070）

成簇的规律间隔回文重复序列及其相关蛋白系统（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ Clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein，CRISPR/CAS）是细菌中广泛存在的应对噬菌体的免疫系统［1-2］。该系统由CRISPR非编码RNA基因及一系列CAS蛋白基因组成。CAS蛋白根据功能可分为3部分，分别作用于CRISPR/CAS介导的免疫反应的3个阶段：在“获得”（Adaptation）阶段，一部分CAS蛋白质可以从入侵噬菌体基因组中捕获DNA片段并整合在CRISPR位点的回文序列中间，这部分CAS基因是所有CRISPR/CAS系统共有的；在“表达和加工”（Expression and processing）阶段，一部分CAS蛋白负责将CRISPR位点转录出的非编码RNA加工成短的引导RNA（gRNA），它们含有～20个来自噬菌体的碱基，并能与噬菌体DNA互补配对；在“干扰”（Interference）阶段，一部分CAS蛋白具有核酸酶活性与gRNA形成复合体，并在其引导下切割噬菌体DNA，以实现抵抗噬菌体入侵的功能［3］。

根据CRISPR/CAS系统中构成干扰复合体的蛋白组成，可将该系统分为三大类，第一类干扰复合体包括多个蛋白质分子，第二类干扰复合体仅含有一个蛋白分子，而第三类干扰复合体包含核酸聚合酶和核酸酶等多个蛋白分子［4］。其中第二类因为其干扰复合体较为简单，其机理研究也最为深入，根据其核酸酶的不同可进一步分为3个亚类，分别含有Cas9，Cas12（Cpf1）和Cas13作为其干扰复合体的唯一核酸酶［4-5］。Cas9干扰复合体由1个tracrRNA，1个crRNA和1个Cas9蛋白质组成。tracrRNA的3′末端包含3个短的发卡结构，其5′末端与crRNA的3′末端的重复序列部分互补配对形成双链结构，形成gRNA。gRNA的发卡和双链结构部分与Cas9的REC，WED和PI结构域互作，其crRNA的5′末端20个与噬菌体互补配对的碱基（称为spacer序列）则主要与REC结构域互作，形成Cas9干扰复合体［6-8］。……