董 洁 ，汤道权 ，肖冰心 ，王添艳 ，孙增先 △

（1．徐州医科大学附属连云港医院·连云港市第一人民医院，江苏 连云港 222000； 2．徐州医科大学，江苏 徐州 221004）

沙格列汀（SAX）为二肽基肽酶（DPP－4）抑制剂，单一或与其他降糖药联合使用，可控制患者血糖［1］。3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶A（HMG－CoA）还原酶抑制剂（他汀类药物）可降低2型糖尿病（T2DM）患者心血管事件风险［2］。2013年版美国心脏病学院／美国心脏病协会（ACC ／AHA）指南推荐［3］，40 ～75 岁的 T2DM 患者需服用中等强度或高强度的他汀类药物。沙格列汀经肝脏代谢酶CYP3A4代谢生成5－羟基－沙格列汀（5－OH SAX）［4］，两者都能选择性抑制 DPP －4 活性，增强其降糖效果。阿托伐他汀（ATO）在体内代谢也需要CYP3A4酶参与。目前尚未见报道沙格列汀及阿托伐他汀联合用药的相互作用，本研究中建立超高效液相色谱串联质谱法（UPLC－MS／MS）测定 ATO，SAX，5－OH SAX 的药物浓度，用于T2DM大鼠体内药代动力学研究。现报道如下。

1 仪器、试药与动物

仪器：Waters ACQUITY Sample Mange－FIN型液相色谱仪（美国 Waters公司）；AB Qtrap 4 500型质谱仪，Analyst1．6．2数据处理软件（美国 ApplicedBiosystems公司）；T1型氮气发生器（德国普利赛斯公司）；AE－240型电子天平（瑞士梅特勒－托利多仪器有限公司）；Peqlab多功能高速离心机（德国Deutschland公司）；Vortex－genie 2漩涡混合器（美国ScientificIndustries公司）。

试药：阿托伐他汀钙（批号为20170320，纯度为99．9%，浙江海正药业股份有限公司）；沙格列汀水合物对照品（批号为 SG－31204001，纯度为 94．36%，郑州华文化学品有限公司）；5－羟基－沙格列汀（批号为20160303，纯度为 95．6%），维格列汀（批号为 20151203，纯度为99．5%），均由江苏豪森药业有限公司提供；乙腈（色谱纯，美国Tedia公司）；醋酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；Millipore超纯水。

实验动物：SD大鼠，雄性，SPF级，体质量80～120 g，购自上海西普尔－必凯实验动物有限公司，许可证号为SCXK（沪）2013－0016，饲养于徐州医科大学实验动物中心。所有动物实验均按徐州医科大学动物饲养和使用指南进行。

2 方法与结果

2．1 色谱条件与质谱条件

色谱柱：WatersBEHShieldRP18柱（100mm×2．1mm，1．7μm）；流动相：10mmol／L 乙酸铵水溶液（A），乙腈（B），梯度洗脱，0～2．2 min，30% ～70%B，2．2～3．1 min，70% ～30%B，3．1 ～5．0 min，30%B；流速：0．2 mL ／min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

采用电喷雾电离源（ESI），以多反应监测（MRM）模式扫描，正离子方式检测。离子化电压：5 500 V；温度：350 ℃；喷雾气（N2）压力：60 psi；辅助加热气（N2）压力：50 psi；气帘气体（N2）压力：35 psi；碰撞气模式：Medium；扫描时间：100 ms。用于定量分析的离子反应 m／z分 别为 559．3→440．2（ATO），316．2→180．2（SAX），332．3→196．2（5 －OH SAX），304．2→153．9（维格列汀，内标）。

2．2 溶液制备与血浆样品处理

对照品溶液：取ATO，SAX，5－OH SAX对照品，精密称定，ATO用水－甲醇（50∶50）溶解并稀释，SAX及5－OH SAX用水－乙腈（50∶50）溶解并稀释，配成质量浓度皆为1 g／L的混合对照品贮备液。用水－甲醇（50∶50）将ATO及5－OH SAX依次稀释成质量浓度为10，25，50，100，250，500，1 000，2 500，5 000 ng ／mL 的溶液，SAX 质量浓度为 20，50，100，200，500，1 000，2 000，5 000，10 000 ng／mL 的对照品工作液。

内标（IS）溶液：取维格列汀对照品，精密称定，用水－乙腈（50∶50）溶解并稀释，配成质量浓度为1 g／L的内标贮备液。临用前，用水－甲醇（50∶50）稀释定容至500 ng／mL。配置好的对照品贮备液及内标贮备液置－20℃冰箱贮存，备用。

混合血浆样品：取适量ATO，SAX，5－OH SAX标准工作液，加入空白血浆，配制成含ATO及5－OH SAX质量浓度为 1，2．5，5，10，25，50，100，250，500 ng ／mL的溶液，SAX 质量浓度为 2，5，10，20，50，100，200，500，1 000 ng／mL的系列混合血浆样品溶液。同法制备定量下限、低、中、高质量浓度的质控血浆样品溶液，即ATO及 5 － OH SAX（1，2．5，50，250 ng／mL），SAX（2，5，100，500 ng／mL），－20℃贮存，备用。

血浆样品处理：取空白血浆50 μL，加入500 ng／mL内标工作液 10 μL、乙腈 250 μL，涡旋振荡 3 min，13 500 r／min离心10 min，移取上清液，在室温下氮气吹干。残留物用100 μL水－甲醇（50∶50）复溶，涡旋振荡1 min，13 500 r／min 离心 5 min，取上清液 10 μL，进样。

2．3 方法学考察

专属性考察：分别取6个SD大鼠空白血浆样品；空白血浆加入ATO，SAX，5－OH SAX及内标溶液；大鼠给药0．5 h后收集血浆样品，按照2．2项下血浆样品操作，行 UPLC－MS／MS 分析，色谱图见图 1。ATO，SAX，5－OH SAX 及 IS的保留时间分别为 3．77，1．91，1．63，1．67 min，保留时间 1．01 min 处发现内源性物质峰，但不干扰ATO，SAX，5－OH SAX及内标溶液的测定，为了尽量减少内源性物质对仪器的污染，将1．40 min之前的组分切外，结果见图1。

标准曲线制备及定量下限考察：取2．2项下混合血浆样品溶液，按血浆样品处理方法处理，并按拟订色谱及MS条件进样测定，记录色谱图。分别以待测物质量浓度（X）为横坐标、待测物峰面积与内标峰面积比值（Y）为纵坐标，用加权（W＝1／X2）最小二乘法进行回归运算。ATO 标准曲线为 Y＝0．00144X＋0．00742（r＝0．9986），定量限为1ng／mL；SAX标准曲线方程为 Y＝0．00466X＋0．002 12（r＝0．999 5），定量下限为 2 ng／mL；5－OH SAX 标准曲线方程为 Y＝0．009 07X＋0．000 473（r＝0．996 5），定量下限为 1 ng／mL。结果表明，ATO，SAX，5－OH SAX 质量浓度在 1～500，2～1 000，1～500 ng／mL范围内与峰面积线性关系良好。

1．ATO 2．SAX 3．5 － OH SAX 4．IS A．空白血浆 B．空白血浆加入ATO，SAX，5－OH SAX及IS C．SD大鼠灌胃ATO，SAX 0．5 h后的血浆样品加IS

精密度及准确度试验：分别制备含 ATO，SAX，5－OH SAX定量下限、低、中、高4个质量浓度的混合QC血浆样品溶液，各5份，按2．2项下方法处理，进样测定，并记录色谱图。连续测定3 d。采用当日所建立的标准曲线计算样品测定浓度，根据测定值与实际值进行计算，考察方法的精密度与准确度。结果显示，3 d内、日间 RSD＜9．34%，准确度为92% ～110%，符合生物样品分析的要求。结果见表1。

表1 ATO，SAX，5－OH SAX日内及日间精密度与准确度实验结果

提取回收率和基质效应试验：取ATO，SAX，5－OH SAX混合QC血浆样品（n＝5），按2．2项下方法操作，进样分析，记录相应分面积（A）。取空白血浆 50 μL，加入乙腈250 μL，涡旋，离心，吹干上清液，在残渣中加入5 μL 含 ATO，SAX，5－OH SAX 的混合标样溶液（浓度与相应的质控样品一致），10 μL 内标，溶液 100 μL水－甲醇（50∶50）涡旋混匀，离心，取上清液进样分析，记录各组分峰面积（B）。以纯水代替空白血浆，进行上述操作，进样分析，记录各组分峰面积（C）。基质效应＝A／C×100%，提取回收率＝A／B×100%。结果表明，ATO，SAX，5－OH SAX及内标的基质效应为 84% ～107%，提取回收率为89% ～103%（n＝5），RSD＜11%。表明在本试验所选择的色谱条件下，可忽略基质效应影响。

稳定性试验：分别考察混合质控血浆样品在不同保存条件下的稳定性（n＝3）。血浆样品在室温下放置24 h，－80℃保存60 d及反复冻融3次等处理后，按2．2项下方法操作，进样分析。结果 ATO，SAX，5－OH SAX 的相对误差（RE）值分别为 0．7 ～10．6，0．8 ～8．7，2．1 ～ 10．1。

2．4 药代动力学研究

取6只SD大鼠，普通饲料适应性喂养1周，给以高脂饲料喂养4周，大鼠禁食、不禁饮12 h，给以链脲佐菌素（STZ，40 mg ／kg）腹腔注射，诱导糖尿病模型，选择造模成功的大鼠模型进行实验。T2DM大鼠同时给予SAX及ATO各10 mg／kg灌胃。分别于给药前后0，0．25，0．5，0．75，1，1．5，2，3，4，6，8，12 h 时采血，各 0．5 mL，置EP管，血样在 4℃下，4 000 r／min离心 15 min，取上层血浆于－80℃冰箱保存。采用UPLC－MS／MS法测定不同时间点的ATO，SAX，5－OH SAX的血药浓度和药－时曲线，详见图2。采用Win Nolin 6．1软件按照非房室模型进行处理，计算药代动力学参数，结果见表2。

图2 T2DM大鼠体内ATO，SAX，5－OH SAX的药－时曲线

表2 ATO，SAX，5－OH SAX在T2DM大鼠体内的药代动力学参数± s）

表2 ATO，SAX，5－OH SAX在T2DM大鼠体内的药代动力学参数± s）

药代动力学参数ATO SAX 5－OH－SAX生物半衰期（t1／2，h）达峰时间（Tmax，h）峰浓度（Cmax，ng／mL）药－时曲线下面积（AUC0－t，h·ng·mL－1）药－时曲线下面积（AUCinf，h·ng·mL－1）平均驻留时间（MRTinf，h）4．08 ± 1．64 0．25 ± 0．00 49．17 ± 2．76 112．38 ± 20．97 1．84 ± 0．47 0．25 ± 0．00 1 155．97 ± 144．96 1 475．50 ± 337．23 1．70 ±0．55 0．65 ± 0．12 376．54 ± 21．87 700．91 ± 147．62 135．79 ± 19．621 496．09 ± 348．83707．34 ± 145．20 5．84 ± 0．852．02 ± 0．462．51 ±0．46

3 讨论

T2DM患者需服用调脂药及降糖药，以预防心血管疾病风险，故可同时测定ATO及SAX药物浓度的方法对其药代动力学研究至关重要。目前，国内外与ATO及SAX血药浓度测定的方法有很多，可采用RP－HPLC／UV［5］，LC － ESI－ MS，GC － MS［6］及 HPTLC － UVD［7］等方法测定血浆中ATO浓度，SAX的测定主要采用GC［8］，LC －MS ／MS［9］等方法。相对于本研究中所描述的方法，均具有检测灵敏度不足、采集样本量大、出峰时间长等缺点，且不能同时测定血浆样品中ATO及SAX药物浓度。故对其作适当改进，增强检测灵敏度，样品保留时间缩短到5 min，提高了分析准确度、灵敏度及分析效率。

优化固定相时，曾尝试Acquity UPLC HSS T3 C18色谱柱、Waters BEH C18色谱柱及Waters shield RP C18色谱柱，结果发现，ATO在Acquity UPLC HSS T3 C18色谱柱无吸收峰，使用Waters BEH C18色谱柱，待测物都能检测出，但其中5－OH SAX的响应值过低，但这些问题在Waters shield RP C18色谱柱上均能改善，待测物具有很好的灵敏度及峰形。在流动相条件优化时，曾采用10 mmol／L乙酸铵－乙腈为流动相，开始时尝试等度洗脱，大水相条件下，SAX及其代谢物5－OH SAX能分开，但ATO不能很好地分离，随着有机相比例的增加，最终在有机相为70%时，ATO被很好地分离出来。故待测物在梯度洗脱条件下，有很好的响应值及峰形。

血浆样品前处理对于色谱方法的建立至关重要，将直接影响待测物的可靠性及准确性。通过查阅文献［10－11］发现，ATO及SAX都有采用乙腈沉淀蛋白的方法提取样品，由于SAX极性大，而ATO极性小，因而在吹干后的复溶采用50%的甲醇。结果表明，采用乙腈蛋白质沉淀法处理血浆样品，待测物的基质效应及提取回收率均符合规定［12］。

本研究中采用UPLC－MS／MS法同时测定T2DM大鼠灌胃给药后血浆中ATO，SAX及5－OH SAX的含量，以维格列汀为内标，在正离子模式下检测。结果表明，此方法具有良好的精密度与准确度，符合生物样品分析方法要求，灵敏度和专属性高。研究了ATO联合SAX在T2DM大鼠体内的药代动力学过程，确定了本研究中所建立的方法在非临床药代动力学研究中的适用性，可为其非临床药代动力学及毒理学等研究提供分析方法。