李晓春，王莉芳，郑 旭，徐长根

（陕西省食品药品监督检验研究院，陕西 西安 710065）

《医疗器械监督管理条例》明确提出，国家对医疗器械按照风险程度实行分类管理。第一类是风险程度低，实行常规管理可以保证其安全、有效的医疗器械；第二类是具有中度风险，需要严格控制管理，以保证其安全、有效的医疗器械；第三类是具有较高风险，需要采取特别措施严格控制管理，以保证其安全、有效的医疗器械。根据2017年8月颁布的《医疗器械分类目录》，鼻腔黏膜修复敷料属于无源植入器械中的组织工程支架材料，属Ⅲ类医疗器械。本研究中按照GB／T系列标准对3批鼻腔黏膜修复敷料进行了细胞毒性、迟发型过敏及刺激等生物学评价［1－4］。现报道如下。

1 材料与方法

1．1 材料

材料、药品与试剂：鼻腔黏膜修复敷料分别选择3个不同厂家生产的，每个厂家各选1批，共3批，记为A，B，C批。高密度聚乙烯（批号为K0M357，符合美国药典标准）；氯化钠注射液（批号为160130 3G，西安京西双鹤药业有限公司）；优级胎牛血清（批号为TBD21HY，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）；RPMI培养基（批 号 为 AB10125297，HyClone）；青 链 霉 素混合液（100 ×，批号为 20170503，Solarbio）；胰蛋白酶（批号为SLBP8607V，Sigma）；无菌磷酸盐缓冲液（PBS，批号为05E16B21，武汉博士德生物工程有限公司）；滤器（0．22 μm，批号为 R6EA47847，Millipore）；二甲基亚砜（DMSO，分析纯，批号为20171114，国药集团化学试剂有限公司）；噻唑蓝（MTT，批号为 MKBN7264V，Sigma）。

细胞及动物：细胞株［小鼠成纤维细胞（L929细胞），编号为CX0187，武汉博士德生物工程有限公司］；白化豚鼠（Dunkin Hartley）、新西兰兔，均由西安市迪乐普生物资源开发有限公司提供，实验动物生产许可证号为 SCXK（陕）2014－001。饲养环境为温度22～26℃，相对湿度40% ～70%，实验动物使用许可证号为SYXK（陕）2013－001，均由陕西省食品药品监督检验研究院实验动物管理委员会按照该院实验动物福利伦理审查委员会章程批准实施。

仪器：BS2202S型电子天平（赛多利斯仪器有限公司）；BSP－250型生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；KA－1000型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；SW－CJ－2F型医用净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；HF151型CO2培养箱（上海力康医疗设备有限公司）；XSZ－D2型倒置相差显微镜（重庆光学仪器厂）；Versa Max0310－3264型酶标仪（美国分子仪器有限公司）；LDZF－50KB－Ⅱ型立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）。

1．2 方法

1．2．1 迟发型超敏反应封闭贴敷试验［1，5］

健康、初成年普通级白化豚鼠，雌雄不限，体质量300～500 g，35只。30 只作为试验组（A，B，C 组），每个样品10只；5只作为对照组。试验前，剔除豚鼠背部被毛。

诱导阶段：试验组用吸收性纱布浸透供试品原液1 mL，局部贴敷于每只动物的左上背部位。6 h后除去包扎带和纱布。1周中连续3 d重复该步骤，同法操作3周。对照组以0．9%氯化钠注射液同法操作。

激发阶段：最后1次诱导贴敷后14 d，用供试品和0．9%氯化钠注射液对全部动物进行激发。方法同上，贴敷于每只动物去毛的未试验部位。6 h后除去包扎带和纱布。

动物观察：激发后24 h剃去激发部位及其周围的被毛，温水洗净，擦干。脱毛后至少2 h，按Magnusson和Kligman分级对试验部位评分，其中无明显改变为0级，散发性或斑点状红斑为1级，中度融合性红斑为2级，重度红斑和水肿为3级。并在除去纱布后48 h进行再次评分。

1．2．2 体外细胞毒性试验（MTT 法）［2－4，6］

试验样品及试液制备：无菌条件下将鼻腔黏膜修复敷料与含血清培养基按0．2 g／mL的比例于37℃浸提24 h后 2000r／min 离心 5 min，取上清液，得供试液。取高密度聚乙烯（厚度为1 mm）36 cm2，剪成5 mm×25 mm的小块，加12 mL细胞生长培养液，37℃浸提24 h，过滤除菌，得阴性对照液。5%的DMSO溶液，过滤除菌，现用现配，得阳性对照液。同细胞生长培养液，得空白对照液。

细胞悬液制备：将已培养48～72 h生长旺盛的细胞用消化液消化后加入细胞培养液，吸管吹打，混匀，用血细胞计数板在显微镜下计数，按公式计算细胞密度，C＝ n／4×104，式中 C为细胞密度，单位为个 ／mL；n为计数板四角四大格内细胞总数，单位为个。根据实测细胞密度，加入适量细胞生长培养液配制成试验要求密度的细胞悬液，备用。

方法：将配制好的细胞悬液接种于96孔培养板，设空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和供试品组（A，B，C组），每组各设至少6孔，每孔接种100 μL细胞悬液。置CO2培养箱（含体积分数5%CO2气体）37℃培养24 h后，弃去原培养液。空白对照组加入新鲜空白对照液，阴性对照组加入阴性对照液，阳性对照组加入阳性对照液，供试品组加入相应的供试液，每孔100 μL，置CO2培养箱继续培养72 h后置显微镜下观察细胞形态。每孔加入20 μL质量浓度为5 g／L的MTT溶液，继续培养4 h后弃去孔内液体，加入150 μL DMSO，置振荡器上振荡10 min，在酶标仪570 nm和630nm波长下测定吸光度，按公式计算相对增殖率（RGR）。RGR＝A／A0×100%，式中 RGR为相对增值率（%），A为供试品组（阳性及阴性对照组）吸光度，A0为空白对照组吸光度。RGR按细胞毒性反应分级判定毒性反应分级，0级相对增殖率≥100%，1级相对增殖率为80% ～99%，2级相对增殖率为50% ～79%，3级相对增殖率为30% ～49%，4级相对增殖率为0～29%。

1．2．3 黏膜刺激试验［1］

取健康、初成年普通级新西兰兔，雌雄不限，体质量不低于2 kg。选取鼻腔无明显刺激症状、无缺陷和无损伤的家兔12只，供试品组（A，B，C组）和对照组各3只。供试品组将受试物原液0．3 g涂抹至鼻腔内，24 h内不冲洗，对照组以0．9%氯化钠注射液0．5 mL同法处理。每隔24 h重复上述操作，连续14 d。观察记录鼻腔黏膜刺激情况。末次接触后24 h，无痛处死动物，解剖鼻腔组织，纵向切开，肉眼观察黏膜组织的刺激情况。选取中央部位，经脱水、包埋、切片、HE染色，LEICA生物显微镜观察［7］。按表1规定的计分系统对组织进行评分。试验组动物显微镜评价计分相加后再除以观察总数即得试验组平均计分，最大计分为16分，对照组同法计算。试验组平均计分减对照组平均记分即得刺激指数。刺激指数0分为无反应，1～4分为反应程度极轻，5～8分为反应程度轻度，9～11分为反应程度中度，12～16分为反应程度重度。

表1 鼻腔黏膜组织反应显微镜计分系统（分）

2 结果

2．1 迟发型超敏反应试验结果

于激发后24 h及48 h观察，供试品组及对照组中豚鼠的反应等级均为0，表明3批鼻腔黏膜修复敷料在本试验条件下对豚鼠皮肤无致敏反应。结果见表2。

2．2 体外细胞毒性试验结果

结果见表3。在本试验室条件下，阳性对照组细胞毒性反应级别为3级，阴性对照组细胞毒性反应级别为0级，试验系统有效。3批鼻腔黏膜修复敷料的细胞毒性反应级别均不大于2级，在标准可接受范围内。

表3 细胞毒性试验结果

2．3 黏膜刺激性试验结果

病理检查结果显示，对照组黏膜层上皮结构完整，固有层可见极少量炎性细胞浸润，少数血管充血及极轻度水肿，平均计分为2．33分；试验组黏膜层上皮结构完整，固有层可见极少量炎性细胞浸润，轻度血管充血及极轻度水肿，试验组A批平均计分为4．0分，平均刺激指数为1．67；试验组B批平均计分为5．33分，平均刺激指数为3．0；试验组C批平均计分为4．67分，平均刺激指数为2．33。结果表明，在本试验室条件下，3批鼻腔黏膜修复敷料均有极轻度黏膜刺激，病理检查结果见图1，反应计分及程度见表4。

图1 各组家兔鼻腔黏膜组织HE染色图（×100）

表4 黏膜刺激性试验结果

3 讨论

随着鼻内镜手术技术的提高和普及，鼻科学的发展进入了一个新时代，成为治疗鼻疾病的主要手段之一。在提高治愈率的同时，术后填塞、止血、修复材料的选择也至关重要，成为近年来鼻科学研究的发展方向［8］。本研究中的鼻腔黏膜修复敷料的主要成分是甲壳素［Chitin，（1，4）－2－乙酰氨基 －2－脱氧 －β－ D－葡萄糖］，是自然界中除纤维素外含量最丰富的天然多糖，也是除蛋白质外含量最丰富的含氮高分子，也是宇宙中唯一带正电的阳性食物纤维，被科学界誉为“第六生命要素”，被欧美国家认定为机能性免疫物质［9］。基础研究表明，甲壳素具有良好的生物相容性和生物可降解性，同时还具有促进伤口愈合、抗菌抗感染、止痛止血［10］，促进人体皮肤细胞（特别是角质细胞和成纤维细胞）的生长调节免疫、增强机体免疫、体内可降解等优点［11］。鼻腔黏膜修复敷料为水凝胶，柔软、弹性好［12］，可与伤口更有效、严密接触，能吸收大量伤口渗液，为伤口提供良好的湿润环境，且不会造成敷料与创面之间的积液，更益于伤口愈合［13］。本研究中按照 GB／T16886及 GB／T14233的系列标准，对3批鼻腔黏膜修复敷料进行了生物安全性评价，结果显示，无豚鼠皮肤致敏反应，对家兔鼻腔黏膜仅有极轻度刺激，细胞毒性不大于2级，均在标准规定的可接受范围内。初步认为3批鼻腔黏膜修复敷料毒性较低，有望用于临床。