邵留英 ，瞿发林 △，董文，倪玉佳，钟 月

（1．中国人民解放军第102医院，江苏 常州 213003； 2．南京中医药大学翰林学院，江苏 泰州 210046）

中药颗粒剂具有服用、携带、贮藏、运输方便等特点，深受广大患者欢迎。复方芍甘颗粒的处方出自医圣张仲景《伤寒杂病论》的芍药甘草汤，具有益气、养血、调经、复脉的功效。芍药甘草汤可治疗抗精神病药所致的高催乳素血症［1－2］。我院在此汤剂基础上增加炙甘草，采用现代制剂制成颗粒［3－4］。为控制制剂质量，本研究中对其质量标准进行了研究。现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

高效液相色谱仪（包括CapLC2487紫外检测器，美国Waters公司）；FA1004型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；DHG9240型鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；KH2200DB型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；XS105型电子天平（梅特勒－托利多仪器有限公司）。

1．2 试药

复方芍甘颗粒（中国人民解放军第102医院自制，批号分别为 201703301，201703302，201703303）；白芍对照药材（批号为B26034－1g），甘草对照药材（批号为B26212－1g），均由上海源叶生物科技有限公司提供；芍药苷对照品（批号为110736－201438，含量以96．4%计算），甘草酸铵对照品（批号为110731－200614），均由中国食品药品检定研究院提供；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法

2．1 定性鉴别

白芍［5－9］：取样品适量，研细，称取 0．2 g，置容量瓶中，加乙醇10 mL，30℃下超声提取（功率为100 kHz），处理30 min，过滤，取滤液水浴蒸干，残渣加20 mL水溶解，正丁醇液提取3次，每次20 mL合并正丁醇液，用适量水洗涤，取正丁醇液蒸干，残渣用1 mL乙醇溶解，即得供试品溶液。取芍药苷对照品适量，精密称定，加乙醇定容制成质量浓度为1 g／L的溶液，即得对照品溶液。称取0．5 g白芍对照药材，同法制备对照药材溶液。按处方组成制备不含白芍的复方芍甘颗粒，称取0．1 g，同法制备阴性对照品溶液。分别精密吸取上述溶液各2 μL，点样至同一硅胶G薄层板，以三氯甲烷－甲醇－乙酸乙酯 －浓氨溶液（8∶4∶1∶1）展开，取出，晾干，喷以 5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点清晰。对照品溶液与对照药材溶液、供试品溶液色谱在同一 Rf值处有相同的蓝紫色斑点，阴性无干扰。色谱图见图1 A。

炙甘草［10－11］：取样品适量，研细，称取 0．9 g 置圆底烧瓶中，加乙醚40 mL，回流提取1 h，过滤，滤液水浴蒸干，残渣用甲醇30 mL回流提取1 h，过滤，滤液水浴蒸干，残渣用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用适量水洗涤，取正丁醇液蒸干，残渣用5 mL甲醇溶解，即得供试品溶液。取甘草酸铵对照品适量，加甲醇定容制成质量浓度为2 g／L的溶液，即得对照品溶液。称取1 g甘草对照药材，同法制备对照药材溶液。按处方组成制备不含炙甘草的复方芍甘颗粒，称取0．5 g，同法制备阴性对照品溶液。分别精密吸取上述溶液各2 μL，点样至同一硅胶GF254薄层板（以1%NaOH溶液制备），用乙酸乙酯 －甲酸 －水－冰醋酸（15∶2∶2∶1）展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点清晰，取出，置紫外灯（254 nm）下检视。对照品溶液与对照药材溶液、供试品溶液色谱在同一 Rf值处有相同颜色斑点，阴性无干扰。色谱图见图1 B。

图1 薄层色谱图

2．2 芍药苷含量测定［12］

2．2．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：月泽 Ze month ODS－L C18柱（150 mm×4．6 mm，5 μm）；检测波长：230 nm；流动相：乙腈 －0．1%磷酸溶液（14 ∶86）；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。在此色谱条件下，处方中其他成分对芍药苷的测定无干扰，色谱图见图2。

2．2．2 溶液制备

取复方芍甘颗粒（批号为201703301）适量，研细，取细粉0．4 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加水20 mL，超声提取（温度为30℃，频率为100 kHz）30 min，取出，放冷，加水定容，摇匀；精密量取5 mL，置25 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，离心 10 min，取上清液，用 0．45 μm微孔水膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。取芍药苷对照品，精密称取 12．16 mg，加水制成质量浓度为121．6 μg／mL的对照品贮备液；精密量取对照品贮备液5 mL，加水制成质量浓度为 60．8 μg／mL 的对照品溶液。按处方组成制备不含白芍的复方芍甘颗粒，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2．2．3 方法学考察

线性关系考察：精密量取芍药苷对照品贮备液1．0，2．5，5．0，7．5，10．0 mL，分别置 10 mL 容量瓶中，用水定容，混匀，制成不同质量浓度的对照品溶液，依法进样，测定峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y＝716 782X－20 858，r＝0．999 7（n＝7）。结果表明，芍药苷进样量在0．263 2 ～2．632 0 μg范围内与峰面积线性关系良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液适量，分别于0，4，8，12，24 h时按拟订色谱条件进样。结果的 RSD为1．50%（n＝5），表明供试品溶液在室温24 h内稳定。

重复性试验：取样品（批号为201703301）6份，精密称定，分别制备供试品溶液，进样分析，记录峰面积。结果的 RSD为0．94%（n＝6），表明方法重复性良好。

精密度试验：精密量取质量浓度为60．8 μg／mL的芍药苷对照品溶液，按拟订色谱条件重复进样6次。结果的 RSD为0．34%（n＝6），表明仪器精密度良好。

加样回收试验：取样品（批号为201703301，芍药苷含量为 27．51 mg／g）9 份，精密称定，每份 0．2 g，置 50 mL容量瓶中，精密加入质量浓度为2．631 7 g／L的芍药苷对照品溶液1，2，3 mL，平行操作3份，按拟订色谱条件进样测定峰面积，计算回收率（n＝6）。结果见表1。

图2 芍药苷含量测定高效液相色谱图

表1 芍药苷加样回收试验结果（n＝9）

2．2．4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，采用外标法计算含量。结果批号为201703301，201703302，201703303的样品中芍药苷含量分别为2．45%，2．44%，2．45%，平均 2．45%。

2．3 甘草酸铵含量测定［5］

2．3．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：月泽 Ze month ODS－L C18柱（150 mm×4．6 mm，5 μm）；检测波长：250 nm；流动相：乙腈 －0．017 mol／mL 磷酸溶液（35 ∶65）；柱温：40 ℃；进样量：20 μL。在此色谱条件下，处方中其他成分对甘草酸铵的测定无干扰，色谱图见图3。

图3 甘草酸铵含量测定高效液相色谱图

2．3．2 溶液制备

取样品（批号为201703301）适量，研细，精密称取细粉0．200 3 g，分别置25 mL容量瓶中，加水20 mL，超声提取（温度为30℃，频率为100 kHz），处理30 min，取出，放冷，加水定容至刻度，摇匀，离心10 min，取上清液，用0．45 μm微孔水膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。取甘草酸铵对照品，精密称取10．75 mg，加水制成质量浓度为210．64 μg／mL的对照品贮备液；精密量取对照品贮备液5 mL，加水制成质量浓度为105．32 μg／mL的对照品溶液。按处方组成制备不含炙甘草的复方芍甘颗粒，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2．3．3 方法学考察

线性关系考察：精密量取甘草酸铵对照品贮备液1．0，2．5，5．0，7．5，10 mL，分别置 10 mL 容量瓶中，用水定容，混匀，制成不同质量浓度的对照品溶液，按拟订色谱条件进样，测定峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝752 553X －760 29，r＝0．999 8（n＝5）。结果表明，甘草酸铵进样量在 0．421 28 ～4．212 80 μg范围内与峰面积线性关系良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，4，8，12，24 h时按拟订色谱条件进样。结果的 RSD为0．42%（n＝5），表明供试品溶液在室温24 h内稳定。

重复性试验：精密称定同批样品（批号为201703301）6份，分别制备供试品溶液，进样分析，记录峰面积。结果的 RSD为1．28%（n＝6），表明方法重复性良好。

精密度试验：精密量取质量浓度为105．32 μg／mL的甘草酸铵对照品溶液，按拟订条件依法重复进样6次。结果的 RSD为0．85%（n＝6），表明仪器精密度良好。

加样回收试验：精密称取同一批样品（批号为201703301，甘草酸铵含量为13．27 mg／g）9份，每份0．1 g，置25 mL容量瓶中，精密加入质量浓度为0．635 g／L甘草酸铵对照品溶液1，2，3 mL，平行操作3份，依法制备供试品溶液，测定峰面积，计算回收率。结果见表2。

2．3．4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件分别测定峰面积，计算含量。结果批号为201703301，201703302，201703303样品中甘草酸铵含量分别为1．32%，1．33%，1．33%，平均 1．33%。

3 讨论

3．1 定性鉴别

芍药苷提取方法：考察2015年版《中国药典（一部）》白芍中芍药苷的提取方法，但杂质多、分离效果差。改用水饱和正丁醇液提取，正丁醇饱和水液洗涤［8］，结果杂质少、分离效果好、斑点清晰。

芍药苷展开剂：以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（40 ∶5 ∶10 ∶0．2）［9］为展开剂，阴性有干扰；以乙酸乙酯 － 甲酸 －乙酸 － 水（15 ∶2 ∶1 ∶2）［10］为展开剂，阴性无干扰，但展开效果不好；最终确定三氯甲烷－甲醇－乙酸乙酯 －浓氨溶液（8 ∶4 ∶1 ∶1）［12］展开的效果最好，Rf值为 0．4，阴性无干扰。

表2 甘草酸铵加样回收试验结果（n＝9）

芍药苷点样量、展开温度：考察供试品溶液、对照品溶液和对照药材溶液点样量1，2，3 μL，以展开剂展开、显色剂显色、检视，结果表明，点样量均为2 μL时斑点圆整、清晰；取供试品溶液、对照品溶液和对照药材溶液点于同一硅胶G板上，以展开剂分别在6，20，35℃展开、显色剂显色、检视。结果表明，在20℃时，溶液分离效果最佳。故选择点样量均为2 μL，温度为20℃的条件展开。

甘草酸铵薄层板：曾在硅胶G薄层板上点样，结果展开效果差、斑点不清晰；改在硅胶GF254薄层板上点样，结果展开效果好、斑点清晰。

甘草酸铵展开剂：以乙酸乙酯、甲酸、冰醋酸、水（15 ∶1 ∶1 ∶2）［13］展开，Rf值偏小，故调整比例，以乙酸乙酯、甲酸、水、冰醋酸（15 ∶2 ∶2 ∶1）展开，阴性无干扰，分离效果好。

甘草酸铵点样量、展开温度：考察供试品溶液、对照品溶液和对照药材溶液点样量 1，2，3 μL，以展开剂展开、显色剂显色、检视，结果表明，点样量均为2 μL时斑点清晰，易于辨识；取供试品溶液、对照品溶液和对照药材溶液点于同一硅胶GF254薄层板上，以展开剂分别在6，20，35℃展开，显色剂显色，检视，结果表明，在20℃时，溶液的展开效果好，Rf值适当。故选择点样量均为2 μL、温度为20℃的展开条件。

3．2 含量测定

提取溶剂与方法：根据芍药苷、甘草酸铵的理化特性，选用了甲醇、乙醇、70%乙醇、水为提取溶剂，超声提取，以水提取效率最高，峰形对称，杂质对主峰无干扰，故本试验中选择水为提取溶剂。再对水超声提取和回流提取的提取效率进行考察，结果显示，两种提取方式效率无明显差异，且超声提取操作简单，最终选择超声提取。

提取温度与时间：考察了提取温度、提取时间对提取效率的影响，结果显示，提取温度超过30℃，提取效率无明显增加；而提取时间超过30 min，提取效率变化亦不明显，故选择温度为30℃、超声30 min提取。

流动相及检测波长：曾参考文献［3］采用乙腈－0．017 mol／L 磷酸水溶液 －三乙胺（35 ∶65 ∶0．3）作流动相测定甘草酸铵（实际测得峰是甘草酸的峰，再按系数折算成甘草酸铵，即甘草酸铵的量＝甘草酸的量×1．020 7），结果未出峰，原因是流动相偏碱性，甘草酸铵无法水解成甘草酸，故最终选择乙腈－0．017 mol／L磷酸水溶液（35∶65）为流动相。本试验中选择230 nm为芍药苷检测波长，250 nm为甘草酸铵检测波长，两主峰附近均无杂质峰干扰，且在这两波长下灵敏度更高、峰形更佳。

加样回收试验：复方芍甘颗粒为中药制剂，故加样回收试验中高、中、低浓度对照品加入量为所测供试品成分量的 1．5，1，0．5 倍，各平行测定 3 份，结果更科学、可信。