林 美 ，余爱明 ，沈 晓 ，孟英姣 ，郑华珠 ，王利胜 △

（1．广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006； 2．广州市医药职业学校，广东 广州 510430）

黄芪桂枝五物汤出自张仲景《金匮要略》，由黄芪、桂枝、芍药、生姜和大枣组方，在中医辨证的基础上可加减运用于风湿骨病、糖尿病并发症、中风后遗症、冠状动脉粥样硬化性心脏病、胃病、皮肤病，以及妇科、儿科等疾病［1－2］。方中黄芪为君药，桂枝、白芍为臣药，主要有效成分有毛蕊异黄酮葡萄糖苷［3］、桂皮醛［4］和芍药苷［5］。临床多用水煎剂，影响有效成分煎出的是煎煮时间，但临床关于煎煮时间长短的说法较笼统。各成分协调作用保证疗效，但各成分的化学性质不同，故煎煮时间会影响有效成分的含量及比例，从而影响疗效［6－7］。本研究中探讨了第1次煎煮和复煎过程黄芪桂枝五物汤中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛和芍药苷溶出率－时间的关系，同时建立了动力学方程，为临床用药和制剂工艺研究提供了依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

SKM型数显恒温电热套（山东鄄城光明仪器有限公司）；高效液相色谱仪，包括P680型二元泵，ASI－100型自动进样器，DAD－3000型检测器，变色龙色谱工作站（美国戴安公司）；AΜW120D型电子天平（十万分之一，日本岛津公司）。

1．2 试药

黄芪 Astragalus mongholicus Bunge．，桂枝 Cinnamomum cassia Presl，白芍 Paeonia lactiflora Pall．，生姜 Zingiber officinale Rosc．，大枣 Ziziphus jujuba Mill．，均为市售品，经广州中医药大学中药学院张丹雁教授鉴定为正品；毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（成都普菲德生物技术有限公司，纯度≥98%，批号为170502）；芍药苷对照品（成都克洛玛生物技术有限公司，纯度≥98%，批号为CHB161227）；桂皮醛对照品（成都克洛玛生物技术有限公司，纯度≥98%，批号为CHB171009）。乙腈（迪马科技有限公司，色谱纯）；甲酸（科密欧化学试剂有限公司，色谱纯）；超纯水（广州中医药大学自制）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 各有效成分的总含量测定

按照2015年版《中国药典（一部）》黄芪、桂枝和白芍的有效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛和芍药苷规定方法进行提取和含量测定，结果3种成分的含量分别为 0．45%，2．68% ，7．19% ，均符合药典要求。

2．2 煎煮过程各有效成分含量测定

2．2．1 色谱条件

色谱柱：Uranus C18柱（150 mm ×4．6 mm，5 μm）；柱温：室温；流动相：乙腈（A）－0．2% 甲酸（B），梯度洗脱（0～20 min时 20%A→40%A，20～30 min时 40%A）；流速：1 mL ／min；检测波长：285 nm；进样量：10 μL。

2．2．2 方法学考察

标准曲线制备：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛和芍药苷对照品适量，精密称取，加甲醇溶解定容至2 mL容量瓶中，得质量浓度分别为 0．580，2．665，1．070 g ／L的贮备液，分别精密吸取系列贮备液适量，置10 mL容量瓶中，甲醇定容，得系列梯度溶液。按拟订色谱条件进行测定，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛、芍药苷回归方程分别为 Y ＝0．281X ＋0．139 5（r＝0．999 9），Y＝0．6491X＋48．818（r＝0．9990），Y＝0．009X＋0．0298（r＝0．999 9）；线性范围分别为 5．02 ～150．51 μg／mL，53．30 ～ 1 066．00 μg ／mL，26．48 ～ 794．48 μg ／mL。

精密度试验：取中间质量浓度的混合对照品溶液，按拟订色谱条件连续测定6次。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛和芍药苷峰面积的 RSD分别为1．10%，1．08%，1．25%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批样品，煎煮过程中于同一时间平行取样6份，制备供试品溶液，依法测定。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛和芍药苷含量的 RSD分别为 4．64% ，0．40% ，4．14% （n ＝ 6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液适量，于4℃保存，分别于 0，1，2，4，6，8 h 时测定。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛和芍药苷含量的 RSD分别为 4．07%，0．17% ，1．28% （n＝6），表明供试品溶液在 4 ℃保存8 h内稳定。

加样回收试验：取已知含量有效成分的供试品0．5 mL，共6份，分别精密加入适量毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛、芍药苷对照品溶液，纯水定容至2 mL，进样分析，计算回收率。结果见表1。

表1 黄芪桂枝五物汤中3种有效成分的加样回收试验结果（n＝6）

2．3 煎煮过程各有效成分的动力学模型研究

2．3．1 绘制溶出度曲线

称取处方量药材（组方：黄芪9 g，桂枝9 g，白芍9 g，生姜18 g，大枣4枚），置1 000 mL三口烧瓶中，加入10倍量纯水，浸泡2 h，回流提取，从沸腾开始计时，煎煮2 h，过滤，滤渣加入8倍量纯水，复煎2 h。2次煎煮过程中，定时取煎煮液 1 mL，分别于 0，10，20，40，60，80，100，120 min时取样，取样后补加等量同温度的纯水，继续煎煮。煎煮液于3 000 r／min转速下离心10 min，取上清液，过0．22 μm滤膜，按拟订色谱条件测定含量，计算溶出率［溶出率＝（煎煮液中有效成分的量／有效成分总量）×100%］。平行重复试验3次，以平均溶出率绘制溶出率曲线，详见图1。

可见，2次煎煮过程中，毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷的累积溶出率总体随时间增加而增加，煎煮时间越长，溶出越多。毛蕊异黄酮葡萄糖苷最大溶出率分别为15．18%和 1．41%，2次煎煮最大累积溶出率为16．59%，说明毛蕊异黄酮葡萄糖苷在水中不易溶出；芍药苷最大溶出率分别为51．94%和5．55%，其溶出规律与毛蕊异黄酮葡萄糖苷相似，煎煮过程中含量不断波动，可能是由于苷类物质在加热过程中分解成苷元，导致含量减少，之后成分溶出的增加占主导作用，含量增大，提示苷类物质需要较长的煎煮时间，以保证有效成分的溶出。2次煎煮过程中，桂皮醛的溶出率随着时间的增加，先增大后减少。第1次煎煮时，30 min内桂皮醛含量增加了近30%，达到82．46%，提示桂皮醛在水煎煮过程中能迅速溶出，且溶出较充分，30 min后含量开始不断降低，提示桂枝不适宜长时间煎煮。

图1 煎煮过程中各有效成分的溶出率变化

2．3．2 建立动力学方程

采用Datafit 9．1软件，以时间（t）为自变量、溶出率（Q）为因变量进行拟合，得出溶出率曲线的拟合方程，并采用相关系数（r）和 P评价方程拟合度。r越接近1，P＜0．05说明拟合度越好。结果见表2。可见，各模型的相关系数（r）均大于 0．95，且 P ＞ 0．05，说明建立的模型能较好地反映第1次煎煮及第2次煎煮过程中3种有效成分溶出率－时间的关系。

表2 煎煮过程中3种有效成分溶出率模型拟合结果

2．3．3 验证动力学模型

称取处方量药材，置1 000 mL三口烧瓶中，加入10倍量纯水，浸泡2 h后回流提取，从沸腾开始计时，煎煮2 h，过滤，滤渣加入8倍量纯水，复煎2 h。2次煎煮过程中，定时取煎煮液1 mL，取样时间分别为6，12，25，42，60，84，114 min，取样后补加等量同温度的纯水，继续煎煮。煎煮液于3 000 r／min转速下离心10 min，取上清液，过0．22 μm滤膜，按拟订色谱条件测定含量，平行重复试验3次，计算平均溶出率。结果见表3。比较模型预测值与实测值，第1次和第2次煎煮过程中各取样时间、实测溶出率和预测溶出率的相对偏差不超过10．00%，表明该模型能较好地反映煎煮过程中3种有效成分溶出率的变化过程。

表3 煎煮过程3种有效成分溶出率模型实测值和预测值比较结果（%）

3 讨论

中药汤剂多为复方，且所含化学成分复杂，在煎煮过程中可能会发生复杂的物理化学变化，不同成分的溶出比例随时间而改变，从而影响疗效或产生毒副作用。黄芪桂枝五物汤有抗炎镇痛、增强免疫、保护脑血管、改善脑代谢、减少脑损伤后遗症等作用［8］，其中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷都有增强免疫和改善心脑血管的功能［9］。本研究中，毛蕊异黄酮葡萄糖苷溶出率较低，黄芪甲苷在黄芪桂枝五物汤煎煮过程中溶出较多［10］，提示黄芪桂枝五物汤中起主要作用的是黄芪甲苷，而非毛蕊异黄酮葡萄糖苷。桂皮醛有抗炎和神经保护作用［11］，由图1可知，桂皮醛在水煎液中溶出较多，但煎煮30 min后，桂皮醛的含量逐渐减少，可能是煎煮过程中随水蒸气挥发和被空气氧化所致。2次水煎液同一成分的溶出率相差10倍左右，说明汤剂煎煮2次，取2次煎液混合后服用是有必要的，否则可能会影响血药浓度。本研究中，由于黄芪桂枝五物汤中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛和芍药苷化学成分的性质不同，煎煮过程溶出规律有较大差异。目前，通过熵权法综合考虑各个指标的影响评价整个提取过程，可靠性好［12］，但是每个指标的重要程度不相同。需要综合考虑确定黄芪桂枝五物汤中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷哪个是发挥疗效的主要成分，以及臣药桂枝和白芍中的桂皮醛和芍药苷的重要程度，并对每个指标赋予权重，计算综合评价值，才能更全面地优化煎煮时间。