王婧

【中图分类号】R284.1 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2018）06--01

蛭类是蛭纲科动物的总称，俗称蚂蟥或水蛭，广泛分布在海洋、湖泊、河流等淡水环境或者潮湿的陆地。蛭类在世界上约有400-500种，我国约有100种，已发现89种。虽然迄今作为医学研究的水蛭种类较多，但是在《中国药典》（2010年版）只收载了3种，即蚂蝗（Whitmania pigra Whitman，宽体金钱蛭）、水蛭（Hirudo nipponica Whitman，日本医蛭）或者柳叶蚂蝗（Whitmania acranulata，尖细金钱蛭）。水蛭作为一味传统中药，其疗效在古代《神农百草经》、《名医别录》和《本草纲目》中均有记载。水蛭性平、味咸苦、小有毒。具有“通经、破瘀、消肿”之功效，主治血瘀经闭，症瘕痞块，中风偏瘫，跌扑损伤[1]。水蛭中除了有熟知的水蛭素以外，还有多种生物活性成分，包括蛋白酶、蛋白酶抑制剂、血小板聚集抑制剂、血小板粘附抑制剂等。在临床中广泛用于脑血栓、冠心病、脑水肿等的治疗[2]。据报道水蛭还有改善微循环、改善脑部缺氧、抗纤维化[3]及抑制肿瘤细胞[4]等作用。随着水蛭及其相关产品的开发，其需求量快速增长，水蛭已成为世界性的畅销中药材之一。水蛭种质资源丰富，分布较广，各品种之间的药用效果差异显著[5]，且这些近源物种仅依靠形态特征难以区分和鉴定，加之对于蛭类的分类系统未达到一致，在一定程度上影响了水蛭资源的有效利用。分子生物学鉴定手段方法为水蛭来源的鉴定提供了新的途径。

核糖体DNA 中的内转录间隔区（ internal transcribed spacer，ITS） 序列进化速率较快，在rDNA 中，由于ITS 区不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速度较快，所提供的信息量也大，已被用于生物科内、属内、种间以及群体间的分子系统演化关系研究[6]。近年来也已被用于中药材种内种群间的差异性研究[7]。

血栓心脉宁胶囊适用于脑血栓、冠脉粥样硬化性心脏病、心绞痛等症。其主要成分有川芎、 丹参、 水蛭、 毛冬青、 牛黄、 麝香、槐花、 人参茎叶皂苷、 冰片、 蟾酥。功能主治：益气活血，开窍止痛。用于气虚血瘀所致的中风、胸痹症见头晕目眩，半身不遂，胸闷心痛，心悸气短；缺血性中风恢复期、冠心病心绞痛见上述证候者。

本研究通过对水蛭对照药材、一正药业血栓心脉宁水蛭投料药材以及一正药业血栓心脉宁胶囊成药ITS序列片段的分析，鉴定及讨论其水蛭来源。

1 材料

1.1 材料 血栓心脉宁胶囊（吉林一正药业集团），水蛭投料药材（吉林一正药业集团），水蛭对照药材（中检院）

1.2 试剂 裂解缓冲液（10 mmol/L Tris-Cl （pH8.0），0.1 mol/L EDTA （pH8.0），0.5% （m/V） SDS，20μg/mg RNase）平衡酚TE（pH8.0）（100mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0））蛋白酶K（20 mg/ml）NaAc （3mol/L）EB，溴酚藍，蔗糖，DNA marker，琼脂糖。

2 方法

核糖体DNA 中的内转录间隔区（ internal transcribed spacer，ITS） 序列进化速率较快，在rDNA 中，由于ITS 区不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速度较快，所提供的信息量也大，已被用于生物科内、属内、种间以及群体间的分子系统演化关系研究[7]。近年来也已被用于中药材种内种群间的差异性研究[6]。

采用SDS法提取基因组DNA：称取样品及各对照药材各0.5g，加入液氮研磨至细粉末状，转移至1.5ml的离心管中，加入750μlDNA提取缓冲液（65℃预热），充分混匀后，放入65℃水浴锅中水浴60min，每10分钟摇动一次。加入750μl饱和酚：氯仿（1：1）充分混匀，室温12000rpm离心15分钟，取上清。加入1/30体积的NaAc （3mol/L）和0.54倍体积的异丙醇，轻混后，置于4℃冰箱30min沉淀。室温下12000rpm离心2min，去掉上清液，用70%乙醇洗涤沉淀两次。适量ddH2O溶解沉淀后获得基因组。

通过primer5软件设计ITS基因引物，ITS-F：5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3；ITS-R：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。合成引物用于PCR（奥科生物公司合成）。ITS-PCR反应体系总体积为25 μL，反应体系组成：10×Buffer （ Mg2+ ） 2.5μL，dNTPs Mixture （ 2.5 mmol /L） 2.0 μL，引物（ 10μmol /L） 各0.5 μL，Taq 酶（ 5 U/μL） 0.2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 补至25 μL。扩增条件为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35 次后72 ℃延伸10 min。扩增产物经1.2% 琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，全自动凝胶成像系统拍照。PCR产物经回收纯化后，测序（奥科生物公司）。

3 结果与讨论

3.1 PCR电泳结果

对水蛭对照药材（中检院），水蛭投料药材（吉林一正药业集团），血栓心脉宁胶囊（吉林一正药业集团）三个样本提取基因组，PCR结果如图1所示：

3.2 PCR产物回收测序比对结果

3.2.1 序列特征及碱基组成 经过PCR扩增，得到三个样本的ITS基因片段，他们的ITS序列长度分别为：水蛭对照药材（中检院）972bp，水蛭投料药材（吉林一正药业集团）972bp，血栓心脉宁胶囊（吉林一正药业集团）974bp。

3.2.2 序列分析及blast比对 将水蛭对照药材（中检院），水蛭投料药材（吉林一正药业集团），血栓心脉宁胶囊（吉林一正药业集团）经PCR扩增的到的ITS序列测序后比对NCBI数据库，发现他们与JX885691序列（宽体金线蛭Whitmania pigra Whitman）Blast得分最高，如图2显示序列比较，图3显示进化树图。经过分析认为水蛭投料药材（吉林一正药业集团），血栓心脉宁胶囊（吉林一正药业集团）两个样品水蛭来源与JX885691序列（宽体金线蛭Whitmania pigra Whitman）一致。

讨论

研究ITS序列，为水蛭资源保护和物种资源库建立提供依据，优先保护群体内遗传多样性丰富的种群。可以通过调查和整理，发现并评价选育出优良品质和相对稳定的中药材品种。PCR技术在分析可以进一步对水蛭质量进行评价，包括蚂蟥真伪的鉴别，以及蚂蟥来源鉴别，主要经济性状比较，安全性评价特别是药理评价等方面。

参考文献

中国药典2015年版.一部

黄荣清，骆传环，彭江南，等.水蛭中小分子活性成分的GC-MS 研究[J].中草药，2003，34（9）： 788-789.

贾彦，牛英才，张英博.天然水蛭素对实验性肝纤维化大鼠肝脏结缔组织生长因子mRNA 表达的影响[J].时珍国医国药，2009，20（1）： 95-97.

任青华，牟忠祥，耿延君，等.中药水蛭素对荷瘤鼠Ki-67 与VEGF 表达的影响[J].医学研究杂志，2010，39（6）： 46-48.

Beauchamp K A，Powers D A.Sequence variation of the first internal transcribed spacer（ ITS-1） of ribosomal DNA in ahermatypic corals from California[J].Mol Mar Biol Biotechno，1996，5（ 4） ： 357.

張君毅，郭巧生，吴丽伟，等.我国不同地区半夏rDNA 序列分析[J].中国中药杂志，2006，31（ 21） ： 1768.

Beauchamp K A，Powers D A.Sequence variation of the first internal transcribed spacer（ ITS-1） of ribosomal DNA in ahermatypic corals from California[J].Mol Mar Biol Biotechno，1996，5（ 4） ： 357.