宋光泽 赵慧霞

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤[1]。研究证明许多miRNA在骨肉瘤中的抗转移作用[2]。hsa-miR-34(miR-34)家族成员是肿瘤抑制蛋白p53的直接转录靶点，通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡和细胞周期阻滞在几种类型的癌症中起抑制肿瘤的作用[3]。细胞周期依赖性蛋白激酶4(CDK4)是TargetScan预测的miR-34b靶基因之一。CDK4是蛋白激酶复合物的催化亚基，对于细胞周期G1期进展十分重要。然而，关于在骨肉瘤患者中miR-34b对CDK4的调控作用及相关临床意义尚未研究。本研究旨在探究hsa-miR-34b-3p(miR-34b)与CDK4在骨肉瘤中表达水平及临床意义。

1 材料与方法

1.1 患者资料及样本收集

选取我院2012年3月至2016年3月病理科骨肉瘤患者外检档案中100例冻存骨肉瘤组织及其对应的癌旁组织标本，其中男性与女性病例各50例，年龄8～70岁，平均(17±7)岁，病程1～24个月，平均(5±1.5)个月。其中软组织浸润67例，软组织无浸润33例，肿瘤转移58例，无转移42例。Enneking外科诊断分期：Ⅰ期病例21例，Ⅱa期病例24例，Ⅱb期病例26例，Ⅲ期病例29例。

1.2 方法

1.2.1 MicroRNA、mRNA提取及荧光定量实时PCR(Quantitative realtime-PCR，qRT-PCR) 使用qRT-PCR检测组织中hsa-miR-miR-34b-3p(miR-34b)表达水平。使用TRIzol试剂(Invitrogen)从组织提取总RNA。使用Reverse Transcription Kit(Takara)将RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green(Takara)进行实时PCR分析。利用ABI7500系统(Applied Biosystems)进行qRT-PCR反应。以U6作为内参。用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。qRT-PCR反应条件: 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40个循环。

1.2.2 蛋白免疫印迹(Western Blot，WB)分析 使用WB检测CDK4蛋白的表达水平。使用RIPA蛋白提取试剂(Beyotime)裂解组织，从组织中提取蛋白质。在4 ℃下12 000×g离心10 min后，通过10%SDS-PAGE分离上清液，将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜(Sigma)上。将膜在PBS和5%脱脂乳中封闭1 h，并用针对CDK4的一抗(cell signaling technology)将膜在4 ℃孵育过夜。将膜用HRP缀合的二抗(cell signaling technology)在室温下孵育1 h。……