关亚飞，陈媛媛，冯年捷，周梦舟，汪超*，吴茜*

(1.湖北工业大学 生物工程与食品学院，武汉 430068;2.武汉市华测检测技术有限公司，武汉 430223；3.湖北工业大学 材料与化学学院，武汉 430068)

原花青素也被称为缩合单宁，是一种存在于植物中的多酚类化合物[1-6]。此外，原花青素还具有抗氧化性[7-10]、降脂降压[11]、抗肿瘤[12,13]等生理活性。原花青素以黄烷-3-醇为单位，通过C4-C6或者C4-C8键连接而成，而C4-C8键和C4-C6连接方式出现的比率是3∶1。C4-C8连接而成的二聚体分别为B1，B2，B3，B4，C4-C6连接而成的二聚体分别为B5，B6，B7，B8，在8种异构体中原花青素B2是活性最强的一个二聚体。近年来，金属配合物的研究引起了众多国内外研究者的广泛关注，而原花青素具有较高的超离域度，完整的大π键共轭体系，强配位的-OH基团，和合适的空间构型，故可作为金属离子的良好配合配体。已有研究表明原花青素与Fe3+, Fe2+, Pb2+, Zn2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+等这些金属离子形成配合物后的生物活性明显增强[14-16]，这为天然产物的利用和开发提供了新思路。

因此，本研究选取了莲原花青素和原花青素B2，探讨了莲原花青素金属配合物，并对其金属配合物进行表征，同时分析了化合物抗氧化活性与结构的关系，采用原花青素B2与金属离子作用后进行了研究，并推出了其配合物可能的结构，旨在为原花青素的进一步应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

莲原花青素：实验室提供；乙醇钠、溴化钾、六水合三氯化铁、DPPH自由基、甲醇、甲酸、亚铁氰化钾、硫酸锌、正己烷：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ZabSpec高分辨磁质谱仪 Waters公司；755B紫外可见分光光度计 上海精密仪器仪表有限公司；V-1700紫外扫描仪 日本岛津公司；Thermo Nicolet Nexus 470 FT-IR光谱仪；DF-101磁力搅拌器 上海东玺制冷设备仪器有限公司；CHIUST BETA 2-8 LO真空冷冻干燥机等。

1.3 方法

1.3.1 莲原花青素金属配合物的合成

分别称取莲原花青素和过量金属盐配制成溶液，搅拌后将金属盐溶液滴加到莲原花青素溶液中，充分混合后，用2%乙醇钠溶液调节pH至8，于70 ℃水浴中回流40 min，溶液中产生有色沉淀物。室温下冷却后过滤，用蒸馏水将滤纸上的沉淀洗涤出来，冷冻干燥即得。

1.3.2 莲原花青素金属配合物的红外、紫外表征

取2 mg样品，加入200 mg溴化钾混匀，研磨、压片。在红外光谱仪中先对纯溴化钾薄片进行背景扫描，然后再对含有样品的溴化钾薄片进行扫描。红外光谱条件如下：扫描频率：32 次/s；扫面范围：400～4000 cm-1。此外，用紫外可见吸收光谱观察莲原花青素金属配合物的吸收和莲原花青素金属配合物的变化。

1.3.3 原花青素B2与Fe3+配合物的电喷雾质谱分析

准确称取2.4276 mg原花青素B2溶于10 mL去离子水中，56.76 mg FeCl3·6H2O溶于1 L去离子水中，取上述溶液2∶1(原花青素/FeCl3)置于试管中，充分震荡10 min，静置30 min，待测。

质谱条件：正离子扫描模式，流动注射泵进样，流速 200 μL/h，碎片电压100 V，毛细管电压4000 V，入口电压为180 V，出口电压为40 V，雾化压力30 psi，干燥气体温度350 ℃，速度为5 L/min, 质谱离子范围100～2500 m/z。

1.3.4 原花青素B2与Fe3+反应后清除DPPH能力

分别配制1.5×10-3mol/L的原花青素B2和0.5×10-3mol/L的Fe3+溶液，按一定比例分别加入原花青素B2和Fe3+溶液，定容至2 mL，混匀后静置30 min，再分别向试管中加入60 mg/L的DPPH乙醇溶液2 mL，混匀后，在室温避光反应30 min后于517 nm处测其吸光度，记作A1；以不加样品时的吸光度值为对照，记作A2；以待测样品和DPPH溶液溶剂(乙醇)的混合物的吸光度值为空白，记作A0。平行操作3次，取平均值，公式为：

2 结果与分析

2.1 配合物的物理性质

表1 莲原花青素金属配合物的物理性质Table 1 The physical property of LSPC-M

由表1可知，莲原花青素与金属离子形成的配合物溶解性都比较差，但是在加入金属离子到莲原花青素溶液中后，溶液立刻发生了颜色变化，推测是因为形成了配合物，因此用此溶液进行紫外表征分析。

2.2 莲原花青素金属离子配合物红外表征

图1 不同LSPC金属配合物以及LSPC的红外光谱图Fig.1 The infrared spectrogram of different metalcomplexes of LSPC and LSPC

注：A为LSPC；B为Fe3+；C为Fe2+；D为Cu2+；E为Zn2+；F为Ca2+；G为Pb2+；H为Mn2+。

2.3 紫外分析

图2 不同LSPC金属配合物紫外光谱图Fig.2 The ultraviolet spectrogram of different metal complexes of LSPC

注：A为Fe3+；B为Fe2+；C为Ca2+；D为Cu2+；E为Pb2+；F为Zn2+；G为Mn2+。

表2 原花青素与金属离子鳌合后最大吸收峰Table 2 The maximum absorption peak after the coupling of procyanidins with melalions

由图2和表2可知，在金属离子存在的条件下，LSPC的最大吸收波长和吸收强度都发生了改变，或增强或减弱。这可能是因为这些金属离子可与样品发生配合而导致溶液吸收光谱发生变化[17]。其中在Fe3+，Fe2+，Cu2+，Mn2+和Pb2+离子存在下，莲原花青素的紫外光谱图变化最大，溶液颜色也发生明显变化。而莲原花青素在50 mg/L以内Zn2+离子存在的条件下，最大吸收峰和吸收强度变化都不大，当Zn2+浓度增加到100 mg/L以上时开始有明显的变化。在Ca2+存在的条件下，溶液吸收强度降低，但随着Ca2+的增加，吸收强度增加。提示莲原花青素与金属离子发生了配合作用。

众多的酚羟基(助色团)是影响莲原花青素紫外吸收的主要因素，莲原花青素的A环和B环的共轭结构，使它的λmax出现在波长较大处(200～300 nm)，吸收强度最大。尽管莲原花青素在加入金属离子后，其最大吸收波长和吸收强度不同。莲原花青素金属化合物在紫外光区仍有明显的酚羟基吸收，故仍具有莲原花青素的抗氧化、消除自由基、抗衰老等生物活性[18]。同时，也进一步证明了莲原花青素与金属离子反应的进行。

2.4 原花青素B2与Fe3+配合物的电喷雾质谱

本文采用电喷雾电离(ESI)软电离技术，研究了LSPC与金属离子配合的方式，结果见图3。

图3 原花青素B2与Fe3+配合物的MS谱图Fig.3 MS spectra of procyanidin B2-Fe3+complexes

图中质谱条件为ESI正离子模式，碎片电压为100 V, 毛细管电压为4000 V，入口电压为180 V，出口电压为40 V,雾化压力为30 psi, 干燥气体温度为350 ℃，质谱范围为100～2500 m/z。

对应的单荷m/z[(M+H)+]峰为579.1522的[B2+H]+，对应电荷m/z[(M+H)2+]峰分别为606.1099的[2B2+Fe]2+、633.0691的[2B2+2Fe-2H]2+和895.1738的[3B2+Fe]2+，由此可以看出，原花青素B2与Fe3+的结合方式分别是1∶1，2∶1，3∶1以及原花青素B2与金属离子结合的结构式(见图4)。

图4 原花青素B2的结构式及原花青素B2与Fe3+按1∶1，2∶1，3∶1配合可能的分子结构Fig.4 Structure of procyanidin B2and possible structure of procyanidin B2-Fe3+(1∶1，2∶1，3∶1) complexes

2.5 原花青素B2与Fe3+反应后清除DPPH能力

图5 不同比例原花青素B2和Fe3+对DPPH自由基的清除作用Fig.5 Clearance effects of different ratios of procyanidin B2and Fe3+on DPPH radical

由图5可知，加入少量金属离子后，原花青素B2清除DPPH·的能力增强，当Fe3+与原花青素B2摩尔比为1∶2时，其清除DPPH能力最强，随着金属离子的加入，清除DPPH自由基能力逐渐减弱。

3 讨论

本文以莲原花青素作配位体，与7种金属离子反应，合成了7种莲原花青素配合物，对莲原花青素及金属离子配合物红外光谱分析的结果表明：与金属离子发生配合的部位可能是莲原花青素A环或B环上的邻苯二酚基团，莲原花青素金属配合物保留了莲原花青素的基本骨架结构，仍然存在酚羟基的吸收。因此，莲原花青素金属配合物能够提供氢，仍然具有抗氧化、消除自由基、抗衰老等生物活性。加入金属离子后，莲原花青素的最大吸收峰和吸收强度都发生了变化，但是在紫外光区仍有明显的吸收，说明有金属离子存在的莲原花青素仍具有抗氧化、消除自由基、抗衰老等生物活性。此外，探究了原花青素B2与Fe3+的结合方式，其结合方式分别为1∶1，2∶1，3∶1。与金属离子反应后，其清除DPPH自由基能力增强，而Fe3+与原花青素B2的摩尔比为1∶2时，其清除DPPH自由基的能力最强。