周宏霞，毕乐飞，藏汝瑛

(1.威海市食品药品检验检测中心，山东 威海 264210；2.荣成出入境检验检疫局技术中心，山东 荣成 264300)

酱腌菜是以新鲜蔬菜为主要原料，经不同的腌渍工艺加工而成的各种蔬菜制品的总称。它具有特有的风味，口味好，能增进食欲，促进消化液的分泌，有时为了改善其色泽会添加一些合成色素。在GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中明确规定了酱腌菜中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝、靛蓝等色素允许使用的限量。另外，不能添加如日落黄、诱惑红、赤藓红等色素。目前检测色素的标准方法有：>GB 5009.35-2016《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》、SN/T 3540-2013《出口食品中多种禁用着色剂的测定 液相色谱-质谱/质谱法》、SN/T 3638-2013《出口食品中脂溶性着色剂的测定》、SN/T 4457-2016《出口饮料、冰淇淋等食品中11种合成着色剂的检测 液相色谱法》，这些标准方法未提及酱腌菜的色素检测。国内检测色素的文献涉及到的食品种类有肉制品、饮料、糖果、冰淇淋等，而对于酱腌菜的方法研究报道很少[1-10]。因此，为了加强对酱腌菜的监管，亟需建立酱腌菜中多种色素同时检测的方法。

本文以酱腌菜为研究对象，建立了高效液相色谱法同时检测柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、赤藓红6种色素的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

高效液相色谱仪配紫外检测器 美国安捷伦公司；DL-12氮吹仪 安谱科学仪器有限公司；CM-10A真空泵 津腾实验设备有限公司；Visiprep 24TMDL固相萃取仪 美国Supelco公司；MS3 Digital旋涡仪 德国IKA公司；Neofuge 23R台式高速离心机 上海力申科学仪器有限公司。

甲醇(色谱纯,Merk公司)；氨水、乙酸铵、柠檬酸(均为分析纯，天津科密欧公司)；Cleanert○RPWAX 固相萃取柱(150 mg/6 mL,艾杰尔公司)。

标准储备溶液:柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、赤藓红浓度都为0.5 mg/mL(中国计量科学研究院)。

1.2 试剂配制

柠檬酸溶液：称取20.0 g柠檬酸，加水至100 mL溶解，混匀。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

称取样品2.00 g于离心管中，加入10 mL 1% 氨水溶液，漩涡震荡提取1 min，4000 r/min离心5 min，重复提取至提取液无色，合并上清液，用柠檬酸溶液调节pH至6左右作为净化液。

1.3.2 样品净化

PWAX 固相萃取柱用 6 mL 甲醇、 6 mL水活化后，将 1.3.1中的全部样液过柱，依次用 6 mL水、6 mL甲醇淋洗，抽干。用6 mL 2% 氨水-甲醇洗脱，洗脱液于45 ℃下氮气吹至近干，用1 mL 50% 甲醇-水溶解，经高速离心机(10000 r/min) 离心 5 min，直接上机测定。

1.3.3 仪器条件

色谱柱: Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；流动相:甲醇+0.02 mol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱程序见表 1。

表1 HPLC梯度洗脱程序Table 1 Elution gradient of HPLC

2 结果与讨论

2.1 固相萃取柱的选择

目前色素净化主要有聚酰胺小柱和PWAX 固相萃取柱，采用聚酰胺小柱，不能同时处理赤藓红。PWAX 固相萃取柱是一种混合型弱阴离子交换柱，赤藓红能与其他的色素一起净化处理，简化了操作步骤，经处理后样品中的杂质少，且回收率能达到要求。

2.2 淋洗液的选择

采用6 mL水(pH为4)、6 mL甲醇-甲酸(6∶4)、6 mL 水(pH值6～7)淋洗和6 mL水、6 mL 甲醇淋洗两种方法，发现6 mL水、6 mL 甲醇淋洗，6种色素的回收率相对较高。

2.3 定溶液的选择

查阅文献发现，当样品中有赤藓红时，宜用50%甲醇水溶液定容。但是用 50%甲醇水溶液定容时，对柠檬黄的峰形产生较大的影响，峰形展宽。所以，如果样品中不含赤藓红时，样品宜用水溶解。

2.4 溶解液的净化

由于滤膜对色素有不同程度的吸附作用，因此溶解液经高速离心净化后上仪器检测，而不是过滤膜，这样可以提高回收率。

2.5 流动相的梯度选择

为了便于各个物质能够分离，选用0.02 mol/L乙酸铵溶液与甲醇进行梯度洗脱。最初的0～7 min，如果采用甲醇+0.02 mol/L乙酸铵溶液(5%+95%)变化到甲醇+0.02 mol/L乙酸铵溶液(35%+65%)时，仪器的基线有凸起且明显。不断变化两种流动相的比例发现采用甲醇+0.02 mol/L乙酸铵溶液(10%+90%)变化到甲醇+0.02 mol/L乙酸铵溶液(35%+65%)时，基线变化小，且各种物质能有效地分离。各种物质的色谱图见图1。

图1 混合标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution

2.6 方法的相关系数和检出限

用超纯水配制混合标准溶液浓度为0.5，1，10，25，50 mg/L的标准系列，在1.3.3色谱条件下进样分析，以混合标准溶液浓度为横坐标(X)、其相应的峰面积为纵坐标(Y)建立校准曲线，得到以下6种人工合成色素的回归方程、线性范围及相关系数，方法的最低检测限按 3倍信噪比计算，见表2。

表2 6种色素的线性方程和相关系数Table 2 Linear equation and correlation coefficient of 6 synthetic colorants

2.7 方法的精密度和回收率实验

分别称取同一均匀的空白样品2.00 g，分别加入高、中、低3种不同浓度的各种色素，每个浓度做5个平行，经提取后检测，计算回收率和精密度，见表3。试验表明：3种浓度下酱腌菜样品色素的平均回收率在92.7%～98.4%之间，RSD在1.59%～4.34%之间。

表3 回收率实验和精密度(n=5)Table 3 Recoveries and precision

续 表

3 结论

本方法选择固相萃取-高效液相色谱法对酱腌菜中的柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、赤藓红6种人工合成色素进行检测。灵敏度高，精密度和准确度良好，能满足酱腌菜中6种人工合成色素同时检测的需要。