张萌萌

《中国骨质疏松杂志》社，北京 100102

分子生物学技术是从分子水平研究生物大分子的结构与功能，从而阐明遗传、生殖、生长和发育等生命现象本质的科学。其主要研究领域包括蛋白质体系、蛋白质-核酸体系和蛋白质-脂质体系。分子生物学的兴起是生命科学研究的全新阶段。

骨质疏松症是一种以骨量低下，骨微结构破坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病。与骨质疏松相关的基因、受体、细胞因子是近年来骨质疏松研究的热点。主要集中在钙磷代谢调节激素及其受体基因、性激素及其受体基因、细胞因子及其受体基因、I型胶原蛋白基因等方面。

1 钙磷代谢调节激素及其受体基因

1.1 维生素D受体基因

在骨形成过程中，维生素D3发挥骨代谢重要的调节作用。维生素D3通过与维生素D3受体(vitamin D receptor，VDR)结合[1]，介导钙、磷代谢的生理调节，可促进小肠钙吸收、刺激成骨细胞的增殖、提高成骨细胞活性、促进骨矿化，从而提高骨密度(bone mineral density，BMD)。VDR广泛分布于体内各组织细胞中。

自澳大利亚学者Morrison等[2]首次报道VDR基因多态性与骨密度的关系以来，VDR基因作为调节骨代谢、影响骨密度、预测骨转换的候选基因而备受重视。国内外众多学者对不同国家、不同地区、不同种族的人群进行了大量的研究，结果显示，各国家、各地区基因位点的分布频率及其与骨密度的相关性并不一致。

VDR基因位于第12号染色体长臂13带(12q13)，由9个外显子和8个内含子组成[3]。

目前研究发现的VDR基因多态性位点有20多个，其中研究较为深入的与骨代谢密切有关的基因多态性位点有4个，即位于第8内含子上的BsmⅠ和ApaⅠ酶切位点，第9外显子上的TaqⅠ和位于基因5′端的FokⅠ酶切位点。

2018年1月，Zhang等[4]对58项关于绝经后女性VDR基因多态性与骨密度和骨质疏松风险关系的Meta分析显示，ApaI和FokI等位基因与绝经后骨质疏松存在显著相关性。VDR ApaI多态性显著降低高加索绝经后女性的骨质疏松症风险。亚洲人群中VDR BsmI和VDR FokI等位基因与绝经后骨质疏松风险增加有关。携带ApaI aa基因型的高加索绝经后妇女与股骨颈高BMD相关，携带FokI Ff基因型的高加索绝经后妇女与低股骨颈BMD相关。

Dabirnia等[5]研究VDR基因多态性与伊朗绝经期女性骨质疏松发生的关系。结果发现，ApaI(AA/Aa/aa)和TaqI(TT/Tt/tt)基因频率在绝经期骨质疏松患者和正常对照组之间没有显著差异。Castelán-Martínez等[6]研究534名墨西哥绝经后女性Apa1 VDR多态性与骨质疏松症的关系。结果发现，Apa1等位基因频率在各组间没有差异，Apa1基因型与骨质疏松及骨质疏松性骨折的发生没有关联。马倩倩等[7]研究长春市汉族女性维生素D受体基因BsmⅠ和FokⅠ位点多态性与骨密度相关性，结果显示，230名长春市35～85岁汉族女性人群中，BsmⅠ位点基因型分布以bb型为主，b等位基因频率高达90.2%，各基因型骨密度无差异；FokⅠ位点ff型有较低的BMD，但在未绝经组中差异无统计学意义，在绝经后女性中ff型与低BMD相关。

1.2 降钙素受体基因

降钙素是骨代谢的重要调节因子之一，由甲状腺滤泡旁细胞分泌，可以抑制破骨细胞的成熟、减少破骨细胞的数量，抑制破骨细胞的分化、降低破骨细胞活性，促使破骨细胞的凋亡，从而抑制骨吸收，同时还可促进成骨细胞增殖，加快骨形成，起到保护、修复骨组织的重要作用，防止骨质疏松及骨质疏松性骨折的发生。

降钙素通过与分布在骨骼中的破骨细胞及其前体细胞膜上的降钙素受体(calcitonin receptor，CTR)结合发挥调节钙磷代谢、维持骨代谢平衡的作用。CTR为G蛋白偶联受体家族成员，通过G蛋白介导[8]激活cAMP传导通路，抑制破骨细胞生成，增加骨密度，促进骨骼再生。降钙素受体成为骨质疏松症的治疗靶标[9]。

降钙素受体基因定位于人第7号染色体(7q21.3)上[10](基因序列号为AC007078)，分子量为85 000～90 000，包含490个氨基酸。研究表明，CTR基因共有11个多态性位点，其中有10个多态性位点存在单核苷酸多态性突变。研究发现，CTR基因第1377处的核苷酸序列C突变为T，导致翻译的蛋白序列脯氨酸突变为亮氨酸，从而产生CC、TT、CT 3种多态基因型。对于CTR基因CC、TT、CT多态性的分布及其与骨密度的相关性研究，不同国家、不同地区结果并不一致。

杨军等[11]对406名汉族绝经后女性CTR基因多态性的研究结果显示，CTR基因分布以CC型为主，CTR基因可能为上海地区绝经后女性骨质疏松的易感基因之一。Wolfe等[12]对美国高加索人、美国黑种人、西班牙裔美国人及亚洲人的CTR基因多态性分布进行研究，分析结果显示高加索人种的CC型基因最少。Masi等[13]发现CC基因型的BMD明显高于TT基因型。Ankam等[14]对447例患有骨质疏松和慢性牙周炎的南印第安人降钙素受体基因多态性的一项观察性研究显示，CTR基因多态性与骨质疏松和慢性牙周炎呈正相关，TT纯合子基因型患者骨密度较低，TT型患者更容易发生骨质疏松症。徐江波等[8]探讨新疆地区汉族及维吾尔族人群CTR基因型频率分布及其与原发性骨质疏松的关系，结果显示，汉族CC型占68.9%，CT型占30%，TT型占1.1%；维吾尔族CC型占54.4%，CT型占33.3%，TT型占12.2%；汉族C等位基因频率占82.8%，T等位基因频率占17.2%；维吾尔族C等位基因频率占72.2%，T等位基因频率占27.8%，提示CTR基因多态性分布存在民族差异。但汉族骨质疏松组与对照组、维吾尔族骨质疏松组与对照组VDR基因型及等位基因频率比较差异无统计学意义。Zhang等[15]对汉族人群CTR基因多态性C1377T与骨密度关系的一项荟萃分析显示，CTR基因的C1377T多态性与绝经后汉族女性腰椎骨密度相关，但与股骨颈BMD无关，CTR基因可能成为预测中国绝经后女性骨质疏松症发病风险的有用遗传标记。

1.3 甲状旁腺素基因

甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)是调节钙、磷代谢水平的重要激素，由甲状旁腺主细胞合成分泌，由84个氨基酸的碱性单链多肽，基因基因全长1156 bp，定位于11号染色体短臂[16](11p 15.1～15.3)。PTH促进血钙水平升高、血磷水平下降，精细调节骨的合成、分解代谢，对成骨细胞和破骨细胞的分化、成熟、凋亡发挥重要作用。

研究表明，甲状旁腺素基因多态性与骨密度密切相关，是骨质疏松易感性的重要遗传标志，但在不同地区人群中结果存在差异。PTH基因第2内含子具有限制性内切酶BstBⅠ酶切位点，有学者研究表明，BstBⅠ位点基因多态性与骨密度有关。但各地研究结论不一。

日本Hosoi等[17]研究383名绝经后女性BstBⅠ等位基因多态性与骨密度的相关性，结果发现，Bb基因型腰椎骨密度明显低于BB型，认为BstBⅠ位点多态性是低骨密度的一个敏感标记。Laaksonen等[18]研究芬兰成年人维生素D受体、钙敏感受体和甲状旁腺激素基因多态性与钙稳态和骨密度的关系，结果显示，PTH BstBI基因型bb的前臂BMD最低。谢丽华等[19]探讨福州地区绝经后妇女 PTH BstBⅠ基因多态性与骨密度的相关关系，分析结果显示，BB型占68.8%，bb型占7.1%，Bb型占24.1%，BstBⅠ多态位点与骨密度无相关性。

2 性激素及其受体基因

性激素(sexhormone)是由性腺、胎盘、肾上腺皮质网状带等组织合成的甾体激素，化学本质是脂质，具有促进性器官成熟、副性征发育及维持性功能等作用。雌性动物卵巢主要分泌雌激素、孕激素两种性激素，雄性动物睾丸主要分泌以睾酮为主的雄激素，雌激素以雌二醇的活性最强。

雌激素对骨代谢、生殖系统、心血管系统、免疫系统、中枢神经系统、胰岛功能等均有重要生理作用。大量动物实验和临床试验研究表明，雌激素可促进骨骼生长发育成熟，刺激软骨生成，抑制骨质流失，促进骨骺生长板融合，改善钙代谢异常，保持骨量，维持骨的动态平衡，降低骨折发生率，雌激素缺乏是导致绝经后骨质疏松的主要原因[20]。

雌激素主要通过与成骨细胞和破骨细胞的雌激素核内特异性受体(雌激素受体，estrogen receptor，ER)结合而发挥生物学作用[21]。雌激素受体属于类固醇激素受体家族，在体内分布广泛，目前发现的主要有3种[22]：雌激素受体α(ERα)、雌激素受体β(ERβ)、以及G蛋白偶联雌激素膜受体GPR30/GPER1。其中ERα、ERβ位于细胞核内，是经典的核受体，介导是一种配体依赖转录因子，调节特异性靶基因的转录[23]，从而发挥“基因型”调节效应；G蛋白偶联雌激素膜受体属于膜性受体，介导快速非基因效应，通过第二信使发挥间接转录调控功能[24]。

雌激素与成骨细胞内的ER结合后，刺激成骨细胞释放生长因子、细胞因子，并分泌胶原酶，提高成骨细胞Ⅰ型胶原mRNA水平，促进骨重建过程；与破骨细胞内的ER结合后，抑制其溶酶体酶的活性，抑制骨吸收活性，促进破骨细胞凋亡，并降低其在骨切片上产生凹陷的能力。此外，雌激素还可降低甲状旁腺素对骨的吸收，预防骨丢失；并促进降钙素分泌，CT与破骨细胞上的CTR结合后，可抑制破骨细胞活性，减少骨吸收。目前，ER基因与骨密度关系的研究已成为骨质疏松的主要研究方向。

编码ERα的基因位于第6号染色体长臂6q25.1，14万个碱基对，含有595个氨基酸，包括8个外显子和7个内含子，分子量为66 Ku。ERβ基因位于第14号染色体长臂，由485个氨基酸组成，分子量为54 Ku。ER基因发生突变对其生理作用的发挥有巨大影响，当编码ER的基因变异时，其蛋白分子构象改变，影响雌激素对骨代谢的调节。

马华[25]研究了新疆维吾尔族、汉族女性雌激素受体α基因多态性与腰椎峰值骨密度的相关性，结果显示，ER-α基因 XbaI多态性对新疆地区维吾尔族和汉族妇女腰椎峰值骨密度可能无潜在影响；PvuⅡ多态性可能对维吾尔族妇女腰椎峰值骨密度的达到和维持有关，与汉族妇女腰椎峰值骨密度可能无关联。

Jeediqunta等[26]对印度绝经后妇女ER-α基因 XbaI多态性的研究发现，携带X等位基因妇女的骨密度显著高于携带x等位基因者。作者又对 8名印度南部绝经前妇女ER-α基因 PvuⅡ、XbaI多态性进行研究提示，拥有 PP 及 XX 基因型妇女的BMD明显高于携带pp基因型及 p、x等位基因型的女性。

Erdoqan等[27]对126名土耳其妇女ER-α基因PvuⅡ多态性的研究结果显示，具有 PP 基因型妇女的腰椎BMD高于具有pp 基因型的妇女。Curròa等[28]对ERβ基因第8外显子的AluⅠ多态性位点的研究显示，携带AA基因型的腰椎BMD低于其他人群。Honma等[29]研究日本女性雌激素受体-β二核苷酸重复序列多态性与股骨颈骨折发生率的关系，结果显示，携带CA重复20次序列的女性股骨颈骨折风险低于携带其他CA重复次数序列的女性。

3 细胞因子及其受体基因

细胞因子(cytokine，CK)是由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子低分子量可溶性蛋白质。通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答。具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子是调节骨吸收、骨形成过程的关键中介因子，对骨代谢调节具有重要作用，细胞因子调控机制的障碍可能使骨形成-骨吸收偶联出现失调而导致骨质疏松症。

细胞因子分为白细胞介素(interleukin，IL)、干扰素、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。其中，与骨质疏松密切相关的细胞因子主要有：TNF、IL-1、IL-6、IL-17、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)等。

3.1 肿瘤坏死因子

TNF-α由单核细胞和巨噬细胞分泌的一种多功能生物活性因子，分子量为17 kDa，在体内外都是强有力的骨吸收诱导剂，可直接刺激破骨细胞前体细胞的增殖和分化，诱导破骨细胞形成，增强破骨细胞活性；TNF-α也可以直接或间接作用于骨钙素前体，诱导成熟骨钙素分化，增强骨吸收能力，从而使骨形成减少[30]，诱发骨质疏松。研究表明，TNF-α也可通过与IL-6协同诱导骨细胞凋亡，加重糖皮质激素性骨质疏松的发展[31]。

Dischereit等[32]研究炎症因子对骨代谢与骨折的影响，发现老年人血浆中TNF-α含量明显高于青年人，TNF-α与骨矿含量呈显著负相关性。Zhu等[33]对TNF-α和IL-6基因敲除小鼠预防骨质流失与骨代谢调节机制中的作用研究显示，TNF-α或IL6基因的敲除可显著上调成骨细胞相关基因(Runx2和Col1a1)的mRNA表达，并在体内、体外下调破骨细胞相关mRNA抗酒石酸酸性磷酸酶、基质金属蛋白酶9和组织蛋白酶K的表达，并且TNF-α在抑制骨形成与增强TNF相关激活诱导基因介导的破骨细胞生成方面比IL-6更具潜力。

3.2 白细胞介素

众多研究表明，IL-1、IL-6、IL-17等骨吸收因子可以抑制成骨细胞生成及其活性，从而抑制骨形成，加快骨流失。IL-1、IL-6的表达在炎症诱导的骨吸收过程中起关键作用[34]。Al-Daghri等[35]对沙特绝经后伴或不伴有骨质疏松女性的促炎症标志物(IL-1β、IL-6、TNF-α)与骨转换标志物之间的关系进行评估。结果显示，IL-1β和TNF-α与骨质疏松妇女I型胶原氨基末端肽呈正相关，与健康和骨质疏松女性中骨形成指标骨钙素显著负相关。炎症因子是沙特绝经后女性骨质疏松的一个促成因素。Lin等[30]研究TNF-α和IL-6多态性和瘦素受体联合与相互作用与骨质疏松症的关系，数据显示TNF-α和IL-6多态性与男性和女性骨质疏松相关。

IL-17也是IL-17 A，是一种促炎细胞因子，由T辅助细胞亚型Th17细胞产生，可影响炎症介导的骨丢失(包括绝经后骨质疏松症)中破骨细胞的骨吸收作用。Ke等学者[36]的研究结果表明，低浓度的IL-17 A可能通过在破骨细胞生成期间激活RANKL-JNK途径，来促进破骨细胞前体自噬活性，促进破骨细胞生成。

3.3 胰岛素样生长因子1

IGF-1是骨代谢调节的重要因子之一，在骨形成和骨重建的过程中发挥重要作用。众多研究表明IGF-1能促进成骨细胞的分化、增殖，加快骨矿化[37-38]。IGF-1主要通过结合IGF-1受体(IGF1R)发挥调节骨代谢的作用。人类IGF1R是一种跨膜四聚体糖蛋白，定位于第15号染色体q26.3，基因序列包含21个外显子和20个内含子[39]。IGF-1与骨细胞IGF1R结合后，刺激成骨细胞的增殖分化，促进成骨细胞合成胶原作用，刺激骨形成，抑制骨吸收，使骨形成和骨吸收紧密偶联，增加骨基质密度。

王玉等[40]研究胰岛素样生长因子1受体基因rs2229765多态性与绝经后妇女骨质疏松的相关性，结果显示，IGF-1受体基因rs2229765多态性AA基因型及等位基因A在绝经后骨质疏松组中的分布频率显著高于骨量正常组；rs2229765基因型AA与基因型GG相比，显著增加骨质疏松的患病风险。de Souza等[41]研究发现，Ⅰ型糖尿病患者骨密度降低与外周血单个核细胞中IGF-1、IGF-1R和转化生长因子β1(TGF-β1)表达降低有关。

3.4 转化生长因子β

TGF-β是骨基质中含量最丰富的生长因子之一，由112个氨基酸组成，人TGF-β基因定位于19q13[42]。TGF-β是骨形成与骨吸收的重要偶联调节因子。TGF-β能促进成骨细胞增殖、分化，加快骨形成，刺激细胞外基质合成，促进骨与软骨的形成，同时还能加快破骨细胞凋亡，抑制骨吸收。TGF-β通过特异性受体启动各种生理应答。

4 Ⅰ型胶原蛋白基因

骨组织由1/3的有机物及2/3的无机物构成，其中，Ⅰ型胶原(type I collagen，COL1A1)蛋白是骨基质中含量最丰富的胶原蛋白，占有机成分的80%～90%，对维持骨结构的完整、骨生物力学特性和骨韧性具有重要作用，能指导钙盐沉积与矿化，促进羟基磷灰石晶体形成。Ⅰ型胶原还可调节骨细胞的増殖、分化。

Ⅰ型胶原由一条α1链及一条α2链构成，其中，α1链由位于17q21.3-q22的COL1A1基因编码，与促进成骨细胞增殖分化有关；α2链由位于7q21. 3-q22的COL1A2基因编码，特点是其拥有多位点的启动子，启动不一样的基因表达。

COL1A1及COL1A2基因突变可导致I型胶原α1和α2链氨基酸序列改变[44]，影响I型胶原细胞内、细胞外翻译后修饰，使I型胶原含量、结构、稳定性异常，引起骨矿化异常，与骨质疏松的发生、发展、严重程度密切相关。

张萌萌等[45]研究汉族人群Ⅰ型胶原α1链基因启动子区-1997G/T、+1245G/T多态性及其与骨质疏松的关系。结果显示，COL1A1-1997G/T转换中正常人群以GT基因型为主，骨质疏松患者和骨质疏松骨折患者以GG基因型为主。骨质疏松患者和骨质疏松性骨折患者女性GG基因型BMD均低于GT、TT基因型。COL1A1-1997G/T与BMD显著相关，+1245G/T与BMD无相关性。

Gerdhem等[46]对1044名瑞典老年妇女Ⅰ型胶原蛋白(COL1A1)Sp1结合位点多态性与股骨颈骨密度和腕部骨折的关系进行研究。分析显示，在携带至少一个“s”等位基因的女性中，股骨颈骨密度降低2.7%；与SS纯合子相比，Ss杂合子的手腕骨骨折的优势比为2.73和1.4。COLIA1 Sp1基因多态性，与骨量和骨折之间存在关联。至少有一个“s”等位基因的存在与较低的股骨颈BMD和腕关节骨折有关。

Zhang等[47]研究中国绝经后妇女COL1A1的基因多态性与骨密度的关系，结果显示，COL1A1的rs1800012基因多态性与腰椎骨密度相关。COL1A1基因的单体型分析显示G-G单体型在腰椎中表现出较高的BMD。

综上文献的凝炼，为骨质疏松分子生物学研究拓宽了思路，研究者应根据研究方向、研究目的，选择研究对象，设计研究方案和技术路线，有针对性地选择实验方法，收集有意义的统计学数据，使研究成果更具先进性、创新性。