宋利娜 徐丽丽 罗欢 杨乃龙

青岛大学附属医院内分泌科，青岛 266000

绝经后骨质疏松(postmenstrual osteoporosis，PMOP)是由于女性绝经后雌激素水平下降导致的以骨量减少、骨微结构破坏为特征的骨形成与骨吸收失衡的代谢性骨病，因此雌激素与雌激素受体调节剂[雷洛昔芬(raloxifene，RXL)]均可用于绝经后骨质疏松症的治疗。近年来，内质网应激(endooplasmic stress，ER)对骨质疏松的研究得到广泛关注，有学者认为ER在细胞的增殖分化、分泌、凋亡过程中均发挥着重要作用[1-2]。雷洛昔芬是否通过此途径影响成骨细胞的增殖及分化尚未见报道。本实验将雷洛昔芬(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L)作用于3T3-E1细胞，观察它们对细胞增殖及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活力的影响，同时应用qRT-PCR的方法观察IRE-1、ATF6及eIF2α的表达情况，研究内质网应激通路是否参与SERM对成骨细胞增殖及分化的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

3T3-E1细胞购自上海中科院细胞库，雷洛昔芬购自美国Santa公司，α-DMEM、胎牛血清、双抗(美国GIBCO公司)，DMSO(美国Sigma公司)，CCK8试剂盒、碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，TRIZOL(美国Gibco公司)，反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒(美国Tiangen公司)，引物由上海生物工程技术服务公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养：3T3-E1细胞内加入10%胎牛血清和1%双抗的α-DMEM培养液5 mL，调整细胞密度，接种于合适培养基中，放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每2天换液1次，待细胞增长至80%左右时，取细胞进行实验。

1.2.2CCK8法测定细胞增殖：3T3-E1细胞悬液以1×105/mL密度接种于96孔板，每孔100 μL，放置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h使细胞贴壁。加入终浓度为10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L的雷洛昔芬培养液及仅加培养液的对照组。每组设5个复孔，另设调零孔，继续培养24 h检测吸光度，终止反应。每孔加入10 μL的CCK8溶剂，继续孵育4 h，在酶标仪450 nm波长处测定各孔的吸光度值[D(450)]。

1.2.3ALP活力测定：将细胞消化、离心、重悬，以细胞数1×105/孔接种于96孔板，分组同上，放置37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，每组设3个复孔，另设酚标准孔。具体步骤如下：5 μL细胞培养上清液，缓冲液和基质液各50 μL，充分混匀，37 ℃水溶15 min，加显色剂150 μL，轻轻振摇孔板混匀，于酶标仪520 nm波长下测定各孔的吸光度值(OD值)并记录结果。

培养细胞中ALP活力(金氏单位/gprot)=[(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)]×标准品浓度(0.02 mg/mL)/待测样本蛋白浓度(gprot/mL)

1.2.4qRT-PCR检测IRE-1、ATF6及eIF2α的表达：3T3-E1细胞接种于6孔板，37 ℃、5%CO2条件下过夜培养后加入10-7mol/L雷洛昔芬，于24 h后收集细胞，用Trizol提取细胞样本中总RNA，取1μg总RNA逆转录合成cDNA，然后用RealTime-PCR试剂盒对目的基因进行定量检测，分别取1 μL cDNA，上游和下游引物各0.6 μL，2×Premix 10 μL，反应体系20 μL。反应条件：95℃15 min，95℃15 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。PCR扩增IRE-1、ATF6及eIF2α(表1)，以β-actin为内参，采用计算2-ΔΔCT的定量方法分析数据。

表1 基因序列及其引物Table 1 Gene sequences and primers

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 3T3E-1细胞形态

3T3E-1细胞贴壁生长，呈长梭形、三角形或多角形等不规则形，细胞之间通过长短不一的树突相互连接(图1)。

图1 3T3E-1细胞形态(40×)Fig.1 3T3 E-1 cells Morphology (40×)

2.2 雷洛昔芬对3T3-E1细胞增殖的影响

实验发现，对照组、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L组的OD值分别为0.434±0.029、0.475±0.016、0.539±0.009、0.637±0.018(图2)。3T3-E1细胞增殖测定与对照组相比，实验各组OD值均显著增高(P<0.05)，且随着雷洛昔芬浓度的升高，测定OD值逐渐增高，各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 不同浓度雷洛昔芬对3T3-E1细胞增殖的影响(与对照组比较，aP<0.05)Fig.2 Effects of different concentrations of raloxifene on the proliferation of 3T3-E1 cells(Comparison with control group，aP<0.05)

2.3 雷洛昔芬对3T3-E1细胞成骨分化的影响

实验发现，对照组、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L组的ALP活力值依次为 0.016±0.002、0.031±0.002、0.052±0.004、0.062±0.007(图3)，与对照组相比，实验组各组ALP活力均增高(P<0.05)，且高浓度雷洛昔芬促进成骨活性的能力高于其他浓度组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 不同浓度雷洛昔芬对3T3-E1细胞ALP活力的影响(与对照组比较，aP<0.05)Fig.3 Effects of different concentrations of raloxifene on alkaline phosphatase activities of 3T3-E1 cells(Comparison with control group，aP<0.05)

2.4 qRT-PCR检测IRE-1、ATF6及eIF2α的表达水平

实验发现，对照组细胞24 h eIF2α、ATF6及IRE-1mRNA的相对表达水平为1。10-7mol/L RXL组细胞24 h eIF2α、ATF6及IRE-1mRNA的相对表达水平分别为3.723±0.313、3.619±0.239、4.582±0.875(图4)，雷洛昔芬组IRE-1、ATF6及eIF2αmRNA的表达水平均较对照组增高，差异有统计学意义(P<0.05)。

图4 10-7 mol/L雷洛昔芬对ERS的影响(与对照组比较，aP<0.05)Fig.4 Effect of 10-7 mol/L raloxifene on endoplasmic reticulum stress (ERS)(Comparison with control group，aP<0.05)

3 讨论

雷洛昔芬是第2代人工合成的非类固醇类苯噻吩化合物，是第1个被批准用于预防和治疗绝经后骨质疏松的选择性雌激素受体调节剂[3]，具有组织特异性，对体内某些组织(如骨组织)具有雌激素作用，而对另外一些组织(如乳腺、子宫内膜)表现为抗雌激素作用[4]。与雌激素替代疗法相比较，它不增加子宫内膜的厚度，不引起阴道出血，可显著降低浸润性乳腺癌的危险性，并且对血脂代谢有良好的作用，因此成为临床上防治PMOP的理想选择。

雷洛昔芬能有效治疗绝经后妇女的骨质疏松症。RXL不仅可促进成骨细胞的增殖及分化，从而调节骨形成及骨重建，并且可抑制破骨细胞的活性，从而抑制骨吸收[5]。Curiel等[6]研究发现RLX可降低去卵巢骨质疏松模型的高转换状态，减少胫骨、股骨及腰椎松质骨小梁的重吸收及骨量丢失。研究表明，雷洛昔芬的作用在10-9mol/L～10-7mol/L浓度范围内呈剂量相关性，随浓度的增加对成骨细胞的刺激作用增加，因此本实验应用10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L雷洛昔芬作用于3T3-E1细胞，结果显示CCK8及ALP均升高，亦随雷洛昔芬浓度的增加CCK8及ALP活力升高，表明雷洛昔芬可促进体外培养的3T3-E1细胞的增殖及分化，与以往的研究结果相一致。

内质网是细胞内最大的细胞器，是蛋白质及脂质合成、折叠、翻译后修饰，细胞的应激反应，细胞钙水平等活动的重要场所[7-8]。内质网内未折叠或错误折叠蛋白集聚和膜内外钙离子稳态失衡，内质网失去正常的生理功能从而引发细胞一系列适应性调节过程，称为内质网应激[9](endoplasmic reticulum stress，ERS)。内质网通过激活胞内信号转导来反应腔内未折叠蛋白的压力，称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，UPR是细胞的保护性反应，内质网稳态是否能够恢复，取决于刺激的强度和持续的时间。

现有的研究表明，内质网应激导致的细胞信号转导主要包括以下3条通路：PERK(protein kinase R-liae ER kinase)通路、ATF6(activating transcription factor 6)通路、IRE1(inositol-requiring enzyme 1)通路。内质网应激的过程与免疫球蛋白BiP(immunoglobulin binding protein，or glucose regulating protein78，又称为GRP78)的游离密切相关。在内质网稳态的情况下，GRP78与上述3个蛋白结合，而内质网内环境紊乱时导致Bip与PERK、ATF6及IRE1解离，而与GRP78解离后的3个蛋白分别被激活，启动内质网应激的信号转导通路，对细胞进行保护作用[10]。轻度的内质网应激能够激发成骨细胞的功能，从而促进骨组织的形成。Hamamura等[11]发现，机体处于应激时可通过调节ATF4/CHOP通路影响成骨细胞的分泌及分化功能。目前研究显示，PERK路径能够通过上调eIF-2α的磷酸化水平激活成骨细胞活性，最终增加骨形成并抑制破骨细胞形成以减少骨破坏[12-13]。在低水平的ERS下，ATF4的表达在成骨细胞中升高，同时骨形成因子Runx2等的表达也升高，从而促进骨形成，有效缓解骨质疏松的进展[14]，XBP1能够直接捆绑RUNX2蛋白从而促进骨形成。目前已经发现胍那苄是通过ERS介导的信号通路治疗骨质疏松的药物，并发现对缓解骨质疏松有一定效果[15]。有研究发现成骨细胞的增殖能够通过IRE1信号通路实现，同时能促进成骨细胞分泌胶原蛋白及骨钙素。同时有研究表明，高浓度的蛇床子素能促进ALP蛋白的表达，而过多的ALP蛋白能够在内质网中聚集，超过ER处理范围时引发ERS，而蛇床子素具有性激素样作用。综上所述，ERS与成骨细胞的增殖及分化有密切关系，因此本实验在刺激内质网相关基因表达时，选用了较高浓度10-7mol/L的雷洛昔芬，实验结果发现，内质网相关的IRE-1、ATF6及eIF2αmRNA水平均有所升高，提示内质网应激可能参与了成骨细胞的增殖及分化。

绝经后骨质疏松症常发生在绝经后5～10年，主要与体内雌激素下降有关，临床表现为骨痛、骨骼畸形，严重者可发生骨折，使生活质量下降增加死亡率及病残率，它已成为一种严重的社会公共健康问题。雷洛昔芬作为一种选择性雌激素受体调节剂，与雌激素相比，能够减少子宫内膜癌及乳腺癌的危险性，因此为绝经后骨质疏松症患者提供了又一选择。随着雷洛昔芬在临床上逐渐被应用，其作用机制也逐渐得到深入研究，因成骨细胞的增殖、分化、成熟的过程是一个复杂而精密的调节过程，涉及多个骨生成相关的信号通路，而内质网应激相关通路参与其中及是否有其他机制参与，仍有待进一步研究。