梁学振许波李刚盖帅帅阎博昭李嘉程夏聪敏

山东中医药大学，山东 济南 250355

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量减少、骨组织微结构异常及骨脆性增加为特征的全身性代谢性骨病[1-2]。目前，防治OP的主要手段包括药物干预、饮食调控和运动疗法。西药通常包括骨吸收抑制剂、骨形成促进剂和骨矿化物等三大类[3]，但往往局限于改善临床症状，延缓病情进展且靶向性不强，因此亟需探寻新的思路解决上述问题[4]。中医药在辩证论治原则的指导下结合分期治疗在防治OP方面取得了显著的疗效[5-7]，现代药理学研究表明，补肾活血类中药不但可以提高肠钙吸收、促进成骨细胞矿化、增强细胞成骨性活性、抑制破骨细胞的形成等综合功效[8-9]，而且与西药单向调控机制相比，治疗调控存在双向化，调节效应更具优势[10]。

补肾活血胶囊是山东中医药大学附属医院骨伤科名中医李刚教授在多年的临床实践中，结合中医学“肾主骨生髓”的经典理论归纳总结而成，其主要成分为鹿角胶、丹参、川芎、杜仲、淫羊藿、香附、白芍、茯苓、牛膝、甘草，诸药合用共奏补肾壮筋，活血止痛之功。临床研究表明[11-13]，补肾活血胶囊对于OP具有较好的临床疗效，但其药效物质基础和分子机制至今尚不明确。因此，挖掘补肾活血胶囊的入血活性成分和作用靶点，分析其可能的作用机制，对于补肾活血胶囊的科学内涵的阐述和其临床推广应用具有重要的促进作用。目前针对中药复方方面的研究仅仅通过现有的手段往往具有检测灵敏度低、可靠评价指标少等问题而难以科学、有效、全面地阐释其作用机制。随着网络药理学和生物信息学理论的建立，为研究中药复方潜在活性成分和作用靶点提供了有效的研究策略。本文通过药物口服生物利用度(oral bio-availability，OB)、药物相似性(drug-likeness，DL)等参数对补肾活血胶囊中已报道的所有成分进行系统的筛选以预测其可能靶点，同时检索疾病基因相关数据库和分析GEO芯片挖掘与骨质疏松症发生发展相关的已知与潜在的靶点，借助网络拓扑分析的手段，进一步预测补肾活血胶囊治疗OP的作用靶点，对靶点进行富集分析，探讨其可能的作用机制。

1 方法

1.1 补肾活血胶囊中活性成分的筛选和靶点预测

中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)中收录了约505味中药和约12144相关中药成分，并详细地描述了每一个成分的毒药物动力学(absorption and distribution and metabolism and excretion, ADME)参数，包括OB、DL、Caco-2细胞渗透性、半衰期、血脑屏障、脂水分布系数等。本研究通过检索TCMSP数据库对补肾活血胶囊所有成分进行初步筛选，其中筛选条件为 OB≥30%，DL≥0.18；同时，将获取的活性成分与前期研究结果及相关文献结合分析，并采用 TCMSP 靶点预测模型预测相关活性成分可能的作用靶点。

1.2 补肾活血胶囊“活性成分-靶点网络”构建

本研究通过网络图像化软件 Cytoscape 3.2.1进行补肾活血胶囊“活性成分-靶点网络”的构建和分析，将上述获得的活性成分及靶点导入软件进行相关网络构建，其中用“节点”(node)表示分子、靶蛋白，用“边”(edge)表示成分与靶点之间的关系；采用network analyzer插件进行网络特征分析以明确补肾活血胶囊中较为重要的成分和靶点，同时阅读相关文献以分析其中的相互作用。

1.3 GEO 芯片数据分析OP相关靶点

从GeneExpression Omnibus数据库中下载编号为：GSE7429的芯片数据原始文件，该芯片数据的原始文件主要针对20位绝经后骨密度(bone mineral density, BMD)高低不同女性血液的基因表达谱的基因测序，其中低BMD10个和高BMD10个。本研究利用robust multiarray average(RMA)算法对其原始文件进行了背景校正和矩阵数据归一化处理，同时采用limma包对芯片数据进行二次分析，并结合P值和差异倍数(fold change，FC)进行相关数值的筛选，其中将P<0.01，FC>1.5作为显著差异基因的筛选条件。

1.4 已知的OP相关疾病靶点检索

在TTD、DrugBank数据库、OMIM数据库、GAD和PharmGKB等5个数据库中利用“osteoporosis”作为关键词进行已知的疾病靶点的检索及筛选。删除检索结果中重复的靶点以获得OP发病过程已知的靶点。

1.5 蛋白质相互关系网络构建和关键靶点筛选

本研究将补肾活血胶囊上述的作用靶点和OP相关的疾病靶点分别映射到蛋白质相互作用关系网络中，利用BisoGenet插件对2个蛋白质相互作用关系网络进行绘制，将绘制得到的2个蛋白质相互作用关系网络图采用cytoscape进行合并，抽取其交集网络，即为补肾活血胶囊治疗OP的直接和间接靶点调控网络。

跟踪相关文献并借助自由度、中心中介性、特征向量中心性、紧密度、网络中心性和局部边连通性等指标，采用网络拓扑分析插件CytoNCA筛选出自由度大于所有节点自由度中位数2倍的节点(Big hubs)；然后，筛选网络中的关键节点再筛选其他几个指标大于所有节点中位数的节点，即关键基因。上述获得的相关活血成分及靶点则有可能是直接、间接调控这些节点，发挥抗骨质疏松的作用。

1.6 Pathway 富集分析

本研究采用ClueGO分析插件对上述OP的关键靶点及获得的信号通路进行富集分析，并根据重要程度绘制信号通路占比饼状图；其中ClueGO展示的图像中同一种颜色的节点代表同一类型的信号通路，节点的大小代表了该信号通路的显著性，信号通路的显著性越高节点越大，说明该通路的重要性越高。

2 结果

2.1 补肾活血胶囊活性成分筛选与ADME分析

本研究通过检索TCMSP数据库补肾活血胶囊中所有的已报道的成分及其 ADME参数共搜集到1 186个相关成分。根据OB和DL参数共筛选出249个入血的活性成分(图 1)。利用相关靶点预测技术对上述活性成分进行作用靶点预测，排除重复靶点，共获得145个预测靶点。

图1 根据ADME参数筛选出的补肾活血胶囊活性成分分布图。A： 符合筛选标准的补肾活血胶囊成分；B： 符合筛选标准的补肾活血胶囊各药成分比例Fig.1 ADME parameters distribution of active ingredients in BuShenHuoXue capsule. A： Components that meet the criteria for screening in BuShenHuoXue capsule; B： Component ratio in accordance with the screening conditions in each herb in BuShenHuoXue capsule

图2 补肾活血胶囊活性成分-靶点网络图Fig.2 Compound-target network of BuShenHuoXue capsule

2.2 补肾活血胶囊“活性成分-靶点网络”构建和分析

采用网络图形化工具Cytoscape将上述活性成分及预测靶点绘制出潜在活性成分和作用靶点的关系网络并加以分析，查找网络中的关键节点，以确定补肾活血胶囊中发挥重要作用的成分和靶点。结果如图2所示，通过cytoscape网络构建共获得201个节点和982个关系。分析可知，木犀草素、槲皮素、谷甾醇和山奈酚等有效成分与网络中的多个靶点相互作用，而PPARG、ESR1、AR等靶点也能作用于多个有效成分。“活性成分-靶点网络”分析显示，补肾活血胶囊的有效成分之间存在协同，而协同调控的靶点同时在OP的发生发展中发挥不同程度的作用。

2.3 OP相关基因分析和检索

2.3.1OP相关差异表达基因分析：二次挖掘分析GEO芯片数据库的基因芯片共获取124个明显影响和改变的基因，结合相关文献探究和分析这些明显改变的基因与补肾活血胶囊的作用靶点和OP及其并发症的发生发展的相关关系。差异表达基因热图见图3。

图3 差异表达基因热图Fig.3 Different expression genes of osteoporosis

2.3.2数据库检索已有OP相关靶点：本研究检索了5个国际公认的疾病基因相关数据库，搜集前期研究和报道的与OP发生发展密切相关的已知的相关靶点基因，其中TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB 分别检索到44、0、57、295、10个靶点，删除重复靶点，共检索到356个已知的OP发病过程中相关的靶点。

2.4 补肾活血胶囊治疗OP的蛋白相互作用网络构建与关键靶点筛选

2.4.1补肾活血胶囊治疗OP的蛋白相互作用：网络构建机体的内在调控往往是复杂的调控网络，而不是单一的信号通路支配；不同的信号通路和靶点之间会存在一定程度的信号转导，故药物的治疗作用不仅表现为成分靶点的直接结合，还表现为直接调控靶点与间接调控其他靶点相结合的调控方式。通过蛋白质相互作用关系数据的挖掘为寻找靶点的直接、间接调控作用关系提供了可能。本研究通过蛋白质相互作用网络的构建，挖掘出补肾活血胶囊与之产生直接或间接作用的靶点共6444个，而靶点相互之间的相互联系多达146287种。与此同时，绘制与OP相关靶点的蛋白质相互作用网络，也挖掘出6129个直接或者间接相关的靶点。本研究进一步深入分析补肾活血胶囊影响OP发生发展中的靶点，绘制蛋白质相互作用靶点网络，为网络分析和机制的探讨提供了可能。

2.4.2补肾活血胶囊治疗OP的关键：本研究为进一步寻找网络中关键节点，获得更多节点的传递信息和更高的节点信息传递效率，对补肾活血胶囊调控OP的蛋白质相互作用交集网络和网络节点的拓扑属性分析进行筛选。通过网络拓扑分析，本研究共发现关键节点229个。筛选策略示意图见图4。

图4 补肾活血胶囊关键节点的目标筛选策略图Fig.4 Target screening strategy for key nodes in BuShenHuoXue capsule

2.5 补肾活血胶囊治疗OP的机制分析

本研究利用ClueGO分析上述229个关键节点，挖掘其参与的主要信号通路，研究补肾活血胶囊治疗OP可能的作用机制。分析结果显示，补肾活血胶囊除与直接作用于OP关键节点涉及的信号通路，如Wnt信号通路、TGF-β信号通路和Notch信号通路等有关，还对P13 K-AKT信号通路、VEGF信号通路和甲状腺素信号通路等同时进行调控。见图5。

图5 补肾活血胶囊治疗骨质疏松症信号通路分析图Fig.5 Results of signal pathway analysis of BuShenHuoXue capsule in treatment of Osteoporosis

3 讨论

随着全球人口数量的快速增长和人口老龄化的不断加减，OP患者人数增长率也随之提供，但目前在防治OP方面仍没有一种行之有效的治疗手段。骨吸收抑制剂、骨形成促进剂和骨矿化物等西药在抗OP进展方面发挥了重要的作用，但长时间应用尤其是双膦酸盐的安全性问题越来越受到重视[14]，而抗OP新药的研发工作仍在进行[15]。随着中医药的不断继承与创新，中药在防治OP方面优势正不断被挖掘与研究。

中医古籍文献中并没有“骨质疏松症”这一病名，但根据其临床证候归属于中医学“骨痿”“骨枯”“骨极”范畴，认为其与肾、脾、瘀关系密切，基本病机为肾亏为主，脾虚为辅，血瘀则为促进因素[16]。肾主骨生髓、为先天之本，骨的生长、发育及衰弱均与肾精盛衰关系紧密，故治疗重在补肾。跟踪文献，补肾类中药单体及复方的抗骨质疏松作用已被证实[17-18]。补肾活血胶囊是山东省知名专家在整体观念和辨证论治为特色的中医基础理论指导下结合分期治疗归纳总结而成的临床经验方，在补肝肾、强筋骨等方面展现出良好的临床疗效。本研究利用网络药理学和生物信息学的技术对补肾活血胶囊的入血活性有效成分进行筛选，对其可能的作用靶点进行预测，对其蛋白质相互功能网络进行构建与分析，阐明了补肾活血胶囊治疗OP的直接和间接调控靶点和可能的作用机制。

从富集结果分析可知，补肾活血胶囊抗骨质疏松的分子机制主要与直接和间接调节骨代谢两类信号通路相关。(1)直接影响骨代谢。OP发生发展过程中重要的发病机制是骨吸收和骨形成过程中的动态平衡状态发生异常，故直接影响骨代谢的相关信号通路是调控OP发生发展过程中主要的信号通路，主要富集在MAPK信号通路、Wnt信号通路、TGF-β信号通路、Notch信号通路、雌激素受体信号通路和破骨细胞分化通路等。MAPK信号通路对细胞的增殖、分化进行调控，进而发挥相应的生物作用，在维持骨代谢平衡方面具有重要作用[19]。TGF-β信号通路能通过调节由间叶细胞衍生而来的前体细胞来促进其分别向软骨细胞、成骨细胞分化，抑制破骨细胞的活性[20-21]。Notch信号通路在成骨细胞分化过程的早期阶段表达时诱导成骨细胞中骨保护素的表达抑制成骨细胞向成熟成骨细胞表型和成骨细胞功能发展而抑制破骨细胞形成和骨吸收[22]。(2)间接影响骨代谢。在显著富集的信号通路中仍存在部分调控其他系统的信号通路，如P13 K-AKT信号通路、甲状腺素信号通路、心肌收缩信号通路和VEGF信号通路等。体内代谢之间是相互作用、相互联系的，通过全身其他系统，如循环系统、神经系统等多种代谢可以间接影响或干预骨微环境。

通过上述通路富集结果显示，网络集群信号通路中也包括EB病毒感染、DNA复制、泛素介导的蛋白水解、前列腺癌、酒精中毒、内质网中的蛋白加工等。说明补肾活血胶囊不仅能直接作用于骨代谢相关信号通路，而且还可以通过影响体内多种代谢途径的靶点发挥抗OP作用。故补肾活血胶囊抗OP的主要机制是促进成骨细胞的增殖或抑制破骨细胞的活性以及对活性成分进行双向调节；同时，结果还提示相关通路之间在一定程度上存在多种多样的相互联系，在治疗OP不仅要针对局部关键通路，而且需要针对疾病可能的病因，机体所处的环境采用多靶点、多方向、多系统的干预。上述结果与中医药治疗疾病的特点恰恰相吻合，治病求本、标本兼治，同时也为中医药治疗疾病多靶点、多方面的可行性和优势提供了有利证据。

基于网络药理学和生物信息学分析药物与疾病靶点的相互网络关系能有效地阐明补肾活血胶囊治疗OP的疾病机制，为后续进一步的探讨分子机制和优化实验设计等提供了重要的理论基础，使实验研究更加合理化和可行化。另外，本研究也为药物与疾病的相关机制的研究提供了新的思路和方法，尤其是诊断中药复方与某种特定疾病的分子机制分析。