谢平金 史桐雨 梁桂洪 柴生颋,3* 曹学伟 孙赫1,,

1. 广州中医药大学岭南医学研究中心中医骨伤科学实验室，广东 广州 510405 2. 广州中医药大学，广东 广州 510405 3. 广州中医药大学第三附属医院骨科，广东 广州 510240 4. 广东省中医院骨科，广东 广州 510240

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是以膝关节软骨的变性、破坏及关节周围骨质增生为特征的慢性关节病[1]，随年龄增长而发生率明显增加，是引起老年人关节疼痛和功能障碍的主要原因，且往往病程日久，严重影响患者的生活质量。随着老龄化社会的到来，KOA的发病率目前正快速增长，故对于如何早期防治KOA已成为当前研究的热点。川芎嗪作为活血化瘀类中药川芎中提取的一种有效活性生物碱，在治疗KOA的临床及实验研究中已有相关报道。本研究通过观察川芎嗪对实验性大鼠KOA关节软骨组织学评分、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、Smad1及BMP-2mRNA、Smad1mRNA表达水平的影响来探讨其防治早期KOA的机制，为治疗膝骨性关节炎提供有效途径和应用依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物与分组：健康雄性大鼠35只，体重180～220 g，由广州中医药大学实验动物中心提供。

1.1.2主要试剂：磷酸川芎嗪片(丽珠集团利民制药厂，国药准字：H44024348)；塞来昔布(辉瑞制药有限公司，国药准字J20140072)；木瓜蛋白酶(上海源叶科技有限公司S10011，CAS：9001-73-4)；石蜡(国药化学试剂有限公司)；苏木素伊红染色试剂盒(北京雷根生物技术有限公司)；中强度RIPA裂解液(FD008，弗德生物)；蛋白酶抑制剂混合物(FD1001，弗德生物)；100 mmol/LPMSF(FD100，弗德生物)蛋白磷酸酶抑制剂混合物(FD1002，弗德生物)；BCA蛋白定量试剂盒(FD2001，弗德生物)；蛋白上样缓冲液(5×)(AR1112，博士德)；预染蛋白Marker(Fermentas)；Tris-base(V900483，Vetec)；甘氨酸(G800880，Macklin)；过硫酸铵(A801035，Macklin)；SDS(Biosharp)；丙烯酰胺(0341-1 kg，Amresco)；N.N-甲叉双丙烯酰胺(N813086-100 g，Macklin)；PVDF膜0.45 μm(Millipore)；PVDF膜0.22 μm(Millipore)；脱脂奶粉(232100，BD)；TWEEN 20(Biosharp)；显影定影试剂(国产)TRIzol Reagent(DP424，天根)；逆转录试剂盒(DBI-2220，DBI)；荧光定量PCR检测试剂盒(AOPR-1200，Genecopies)；DEPC(V900882，Vetec)；无水乙醇、异丙醇、三氯甲烷(国产)。

1.1.3主要设备：台式高速离心机(SCIlogex)；纯水仪(重庆艾科浦)；荧光定量PCR仪(7500，ABI)；微量核酸定量仪(SMA4000，Merinton)；多功能酶标仪(上海现科仪器有限公司)；电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；台式高速离心机(SCIlogex)；磁力搅拌器(常州澳华仪器有限公司)；脱色摇床(北京六一仪器厂)；电泳仪(北京六一仪器厂)；水浴锅(姜堰市天力医疗器械厂有限公司)；暗匣(广东粤华医疗器械厂有限公司)；感光胶片(kodak)；封口机PF(温州市江南机械厂)；低温冰箱(西门子)；扫描仪(Canon)；灰度分析软件(Image J)；多功能酶标仪(上海现科仪器有限公司)。轮转式石蜡切片机(德国Leica)。

1.1.4溶液配制：转移缓冲液(2 L)：甘氨酸28.8 g，Tris 4.84 g，甲醇400 mL，加去离子水定溶至2000 mL；电泳缓冲液(2 L)：Tris 6.06 g，甘氨酸37.54 g，SDS 2 g，加去离子水定溶至2000 mL；TBS缓冲液(1 L)：1 mmol/LTris-HCl(pH=7.5)，10 mL NaCl 8.8 g，加去离子水定溶至1000 mL；30%丙烯酰胺(1 L)：丙烯酰胺290 g，BIS 10 g，加去离子水充分溶解后定溶至1 000 mL；非磷酸化蛋白酶抑制剂：每1 mL RIPA试剂中加入5 μL蛋白酶抑制剂和10 μL 100 mmol/L的PMSF，混匀；磷酸化蛋白酶抑制剂：每1 mL RIPA试剂中同时加入5 μL蛋白酶抑制剂、10 μL 100 mmol/L的PMSF、5 μL磷酸化蛋白酶抑制剂，混匀。

1.2 方法

1.2.1分组与造模：将实验动物依据随机分配的原则分为正常组、模型对照组、高剂量组、低剂量组和阳性对照组。每组7只，除正常组外，均采用木瓜蛋白酶关节腔注射建立KOA大鼠模型。用0.9%氯化钠溶液配4%(W/V)木瓜蛋白酶溶液。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后双膝关节备皮、消毒、屈曲约 45°，从髌骨下缘前内侧的膝眼向髁间窝方向进针，明显有落空感后，针尖抵达股骨内侧髁再回撤2 mm，并注射木瓜蛋白酶，分别向双侧膝关节腔注入4%木瓜蛋白酶0.2 mL。每隔3 d注射1次，连续注射3次(即第1天、第4天、第7天注射)。注射后1 w，观察各组大鼠膝关节外观，并在各组各取1只大鼠处死后，取关节软骨行HE切片，验证造模是否成功。

1.2.2干预方法：验证造模成功后，根据磷酸川芎嗪片以及塞来昔布临床上人服用的常规剂量，与大鼠间药物剂量的换算方法进行换算，开始灌胃给药治疗，高剂量组、低剂量组分别给予灌胃磷酸川芎嗪片100 mg/kg和50 mg/kg，每天用药1次；阳性对照组灌服塞来昔布剂量为24 mg/kg，每日定时给药1次，正常组、模型组灌服等量的生理盐水，每天1次，连续灌胃 6 w后处死，右膝胫骨平台行组织切片观察，左膝取软骨组织进行Western Blot蛋白检测、qRT-PCR-检测。所有SD大鼠均按常规进食饲养者提供的大鼠标准饲料和自来水。

1.2.3检测指标：(1)HE切片染色观察。治疗结束后，处死各组实验鼠，右侧膝关节胫骨平台经4%多聚甲醛4 ℃固定、脱钙、脱水、透明、浸蜡、包埋，制作成石蜡标本，行4～6 μm 厚切片。HE染色后在光镜下观察各组切片染色情况，采用改良Mankin’s法[2]对软骨组织结构、细胞、染色以及潮线的完整性评分，评分越高说明软骨退变越严重。(2)Western Blot检测。取-80 ℃保存备用其软骨组织，并根据说明书配制全蛋白提取液，将软骨组织置于全蛋白提取液中，利用匀浆器于冰上破碎软骨组织。匀浆后，采用Braford 比色法测定样品蛋白浓度。加入5×SDS蛋白上样缓冲液(5∶1)，100 ℃煮沸5 min。-20 ℃保存备用。分别置于浓缩胶和分离胶中电泳，350 mA转膜70 min。37 ℃封闭液中封闭1 h；将PVDF膜分别放入装有3 mL稀释后的BMP2抗体(稀释比例1∶1000，转膜条件：300 mA恒流转膜30 min，厂家：abcam，货号：Ab14933)、Smad1抗体(稀释比例1∶1000，转膜条件：300 mA恒流转膜30 min，厂家：abcam，货号：Ab131371)，25 mL TBST洗涤PVDF膜3次，每次5 min；将PVDF膜放入含有3 mL辣根过氧化物酶标记的稀释二抗溶液的小槽内，置于摇床上室温平缓摇动40 min[二抗：HRP Goat anti-Rabbit IgG(厂家：BOSTER，货号：BA1054，稀释比例：1∶20000，孵育条件：室温孵育40 min]，25 mL TBST洗涤PVDF膜3次，每次7 min；用化学发光显色后进行图像分析，经软件分析，以BMP2/β-actin、Smad1/β-actin比值表示BMP2、Smad1蛋白表达水平。(3)qRT-PCR-检测 BMP2 mRNA、Smad1 mRNA表达。采用Trizol 法常规提取关节软骨总RNA，经逆转录获得cDNA 第一链，然后行qRT-PCR进行40个循环扩增，同时追加溶解曲线反应检测引物特异性。引物序列如下：BMP2上游引物：5′-CAGTGGGAGAGCTTTGATGT-3′，下游引物：5′-ACCTGGCTTCTCCTCTAAGT-3′；SMAD1上游引物：5′-GGGACTGCCTCATGTCATTTA-3′，下游引物：5′-AGACTTCCTTCTGCTTGGAAC-3′；GAPDH(内参)上游引物：5′-GCAAGGATACTGAGAGCAAGAG-3′，下游引物：5′-GGATGGAATTGTGAGGGAG ATG-3′。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 软骨组织学Mankin评分

实验结束后，各组行HE切片染色后，除空白组外，各组均出现不同程度的软骨损伤，如表1示，各组软骨Mankin评分中，川芎嗪各剂量组和阳性对照组均较空白组高(P<0.05)，均较模型组低(P<0.05)，且川芎嗪高剂量组<阳性对照组<川芎嗪低剂量组(P<0.05)。

表1 各组软骨组织Mankin评分

注：与空白组对比，*P<0.05；与模型组对比，▲P<0.05；与阳性对照组对比，#P<0.05。

2.2 Western Blot检测软骨组织BMP-2、Smad1蛋白表达结果

正常组、川芎嗪各剂量组及阳性对照组中软骨BMP-2及Smad1蛋白相对表达量较模型组均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组相比，川芎嗪高剂量组BMP-2及Smad1表达量明显高于阳性对照组(P<0.05)，而川芎嗪低剂量组BMP-2及Smad1表达量则低于阳性对照组。见图1、2。

图1 各组软骨BMP-2、Smad1蛋白相对表达量(与模型组对比，*P<0.05；与阳性对照组对比，△P<0.05)Fig.1 The relative expression of BMP-2 and Smad1 protein in cartilage of each group(Comparison with model group，*P<0.05；Comparison with positive control group，△P<0.05).

图2 各组软骨BMP-2、Smad1表达凝胶电泳图Fig.2 Gel electrophoresis of BMP-2 and Smad1 expression in cartilage of each group

2.3 各组软骨BMP-2mRNA及Smad1-mRNA相对表达量

正常组、川芎嗪各剂量组及阳性对照组中，软骨BMP-2mRNA、Smad1mRNA相对表达量较模型组均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组相比，川芎嗪高剂量组BMP-2mRNA、Smad1mRNA表达量明显高于阳性对照组(P<0.05)，而川芎嗪低剂量组其表达则均低于阳性对照组。见图3。

图3 各组软骨BMP-2 mRNA及Smad1-mRNA相对表达量(与模型组对比，*P<0.05；与阳性对照组对比，△P<0.05)Fig.3 The relative expression of BMP-2 mRNA and smad1-mRNA in cartilage of each group(Comparison with model group，*P<0.05；Comparison with positive control group，△P<0.05).

3 讨论

膝骨关节炎是以膝关节软骨的变性、破坏及关节周围骨质增生为特征的慢性关节病[1]。KOA临床上症状多表现为膝关节局部疼痛、晨僵、肿胀、活动受限，严重者可出现关节的畸形，并最终可导致残疾的风险[3]。本病主要见于中老年患者，且往往病程日久，严重影响患者的生活质量，且随着老龄化社会的到来，KOA的发病率目前正以惊人的速度增长，对于如何防治KOA已成为当前的研究热点，因此，对于KOA的早期干预研究，就显得非常必要。中医认为KOA属于“膝痹病”“骨痹”“痹证”等范畴，并以肝肾亏虚为本、瘀血阻滞为标，而发病早期以瘀血阻滞为关键病机。根据传统中医理论，结合临床体会，笔者认为治疗上早期活血化瘀是防治KOA发病的重要环节。川芎嗪(四甲基毗嗪，ligustrazine)是从活血化瘀类中药川芎中提取的一种有效活性生物碱，具有改善关节内微循环，降低骨内压作用[4]。近年相关研究发现，川芎嗪能促进软骨细胞的增殖，同时抑制软骨细胞的凋亡[5]；本课题组前期研究亦发现川芎嗪能明显降低骨关节炎关节液中NO、PGE2的含量水平，对减轻OA炎症有一定的作用[6]。本研究通过观察川芎嗪对实验性大鼠KOA关节软骨组织病理以及BMP-2、Smad1表达水平的影响来探讨其防治OA的机制，为治疗膝骨性关节炎提供有效途径和应用依据。木瓜蛋白酶关节腔注射作为诱导大鼠膝早期骨关节炎的方法，已广泛用于研究[7-8]。本实验采用木瓜蛋白酶溶液关节腔注射制作大鼠KOA模型，并干预6 w后行HE染色切片软骨Mankin评分，Mankin评分越高，说明软骨损伤程度越严重。其中川芎嗪各剂量组和阳性对照组均较空白组高(P<0.05)，均较模型组低(P<0.05)，且川芎嗪高剂量组<阳性对照组<川芎嗪低剂量组(P<0.05)。这充分说明川芎嗪能减轻关节软骨退变且适当提高血药浓度，能更好地减轻关节软骨退变程度。

BMP-2作为BMPs 30种蛋白中的一员，已被证明有刺激蛋白多糖的合成，诱导蛋白聚糖和II型胶原的表达，促进软骨内成骨的能力，并具有对软骨细胞代谢合成代谢的影响[9]。已有研究表明[10]，BMP-2可以提高骨软骨损伤后软骨的修复过程，减少纤维软骨的形成，从而改善软骨基质的外观和构成。长期递送 BMP-2相比较于自体软骨细胞移植，前者可以诱导产生更多的透明软骨[11]。Smad1作为BMP-Smad信号通路的关键分子，其活化是被严格并精确调控的，特别是被大量的负性调控因子所调节，它的负性调节对正常的生理功能发挥有重要的作用[12-13]，Smad1蛋白的表达可能与BMPs信号转导通路调控的软骨内化骨分子机制间存在相关性[14]。本实验研究发现，正常组、川芎嗪各剂量组及阳性对照组中软骨BMP-2、Smad1及BMP-2mRNA、Smad1mRNA相对表达量较模型组均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组相比，川芎嗪高剂量组BMP-2、Smad1及BMP-2mRNA、Smad1mRNA表达量明显高于阳性对照组(P<0.05)，而川芎嗪低剂量组其表达则均低于阳性对照组。这表明适当提高川芎嗪血药浓度，可能通过上调BMP-2mRNA及Smad1mRNA基因的表达，从而促进BMP-2及Smad1蛋白的表达，这可能是在某种程度上减轻关节软骨退变、修复软骨损伤作用的机制之一。但BMP-2、Smad1及BMP-2mRNA、Smad1mRNA表达上调后能否进一步激活软骨细胞特异性的下游靶基因、实现的具体途径如何，还有待进一步的研究。下一阶段将重点研究川芎嗪含药血清调节软骨细胞的分子机制，为川芎嗪在防治OA方面提供新的科学依据和实验方法。