李金贵，黄飚，万华，陈仕高

成都市天府新区人民医院1泌尿外科，2病理科，成都610213

膀胱癌主要发生于50～70岁的老年人群，年轻人群的膀胱癌发病率较低。早期膀胱癌患者的主要治疗方式为手术治疗，5年生存率较高，而晚期膀胱癌患者不仅需要接受膀胱全切术，还需要接受辅助放化疗，并且复发率仍较高[1]。相关研究证实，正常细胞转变为肿瘤细胞以及肿瘤细胞的浸润、转移过程受到多个基因的调控，而对于膀胱癌发病机制的研究也是目前临床研究的重要方向[2]。线粒体融合蛋白2（mitofusion 2，MFN2）基因定位于人体1号染色体短臂36.22，亦称增殖抑制基因（hyperplasia suppressor gene，HSG），极易出现缺失或异位等基因突变[3]。MFN2定位于线粒体外膜，对维持线粒体的正常功能和形态具有重要作用，并且与线粒体的融合功能关系密切。但目前关于MFN2在膀胱癌中的作用机制的研究较少。本研究探讨了膀胱癌组织中MFN2基因和蛋白的表达变化及其临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月至2017年1月成都市天府新区人民医院收治的80例膀胱癌患者的术后膀胱癌组织标本为膀胱癌组。纳入标准[4]：①膀胱癌的诊断标准参考人民卫生出版社《外科学》第七版中的标准；②均经膀胱镜取活组织检测或术后病理学检查确诊为膀胱癌；③术前均未接受放化疗及免疫治疗。排除标准：①病历资料不完整；②伴有其他部位恶性肿瘤者。选取同期于成都市天府新区人民医院行手术切除的40例外伤患者的正常膀胱组织标本为对照组。其中膀胱癌组中，男69例，女11例；年龄45～81岁，平均（64.5±11.8）岁；病理分期：T2期47例，T3期33例；分化程度：高分化56例，中分化14例，低分化10例；有淋巴结转移22例。对照组中，男34例，女6例；年龄40～79岁，平均（65.2±10.2）岁。两组患者的性别、年龄一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫组织化学法检测

采用免疫组织化学法检测膀胱癌组织和正常膀胱组织中MFN2蛋白的表达情况。10%甲醛固定后4℃过夜，脱水后二甲苯透明，常规石蜡包埋并切片，相关试剂盒购自北京奥维亚生物技术有限公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗为阴性对照，阳性对照由上海药物研究所提供，高倍光学显微镜下观察结果。

1.3 RT-PCR技术

采用逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）技术检测膀胱癌组织和正常膀胱组织中MFN2 mRNA的表达水平。取0.1 g膀胱组织，加入1mlTrizol试剂后经氯仿抽提，加入异丙醇沉淀后获取总RNA，RTPCR两步法将RNA逆转录为cDNA后进行扩增，PCR 产物 3 μl和DL2000 Marker凝胶电泳获得mRNA表达图像。

1.4 免疫组化结果判定标准

免疫组化结果判定：MFN2蛋白阳性表达于细胞质，染色呈黄色、棕黄色、褐色。①根据细胞的着色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，褐色、黑色为3分；②根据阳性细胞所占比例评分：阳性细胞所占比例＜1%为0分，阳性细胞所占比例为1%～10%为1分，阳性细胞所占比例为11%～50%为2分，阳性细胞所占比例为51%～75%为3分，阳性细胞所占比例＞75%为4分。将两种积分相乘，总分＜3分为阴性，≥3分为阳性。

1.5 统计学分析

采用SPSS 16.0软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验或连续矫正χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MFN 2蛋白和mRNA表达情况的比较

膀胱癌组织中MFN2蛋白的阳性表达率为73.75%（59/80），明显高于正常膀胱组织的15.00%（6/40），差异有统计学意义（χ2=30.07，P＜0.01）；膀胱癌组织中MFN2 mRNA的相对表达量为（1.173±0.286），明显高于正常膀胱组织的（0.392±0.104），差异有统计学意义（t=16.70，P＜0.01）。（图1）

图1 不同组织中MFN 2蛋白的表达情况（免疫组化染色，×400）

2.2 MFN 2蛋白表达与膀胱癌患者临床特征的关系

中低分化、T3期膀胱癌患者的膀胱癌组织中MFN2蛋白的阳性表达率分别高于高分化、T2期膀胱癌患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄、性别、淋巴结转移膀胱癌患者的膀胱癌组织中MFN2蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 膀胱癌组织中MFN 2蛋白表达与膀胱癌患者临床特征的关系

3 讨论

膀胱癌是泌尿系统最常见的一种恶性肿瘤，其发病率居泌尿系统恶性肿瘤的第1位，男性与女性膀胱癌发病率的比例为5∶2[5-6]。目前，膀胱癌的发病机制尚未明确，通常认为与经常接触致癌物如萘胺、联苯胺等有关，而日常生活中常见的染料、橡胶和塑料制品、油漆、洗涤剂等也有潜在的致癌危险。另外，相关研究表明，吸烟也会增加膀胱癌的发病风险[7-8]。此外，某些疾病如膀胱白斑、腺性膀胱炎、尿道结石、尿潴留等也可能会诱发膀胱癌[9]。

随着免疫遗传学和细胞分子生物学研究的不断深入，关于恶性肿瘤发生、发展机制的研究取得了较大进步，但目前膀胱癌的发病机制仍不明晰，其流行病学及分子生物学研究仍处于初步推测阶段。相关研究结果提示，相关基因及多种信号转导通路的表达异常与膀胱癌的发生、发展具有密切联系，并证实线粒体分解蛋白活性与线粒体融合蛋白活性的相对平衡是保证线粒体功能正常的基础[10]。结合相关研究，总结MFN2主要有以下几类功能：①在早期胚胎发育及卵母细胞成熟分裂的过程中，MFN2蛋白及mRNA表达水平明显增加，囊胚期表达量处于最高峰，进而参与卵母细胞的成熟分裂和组织发育过程[11]；②通过降低Rb磷酸化水平，抑制Ras-Raf-MEK-ERK1/2活化或抑制周期蛋白的表达来抑制细胞生长[12]；③在能力转换和新陈代谢过程中诱导肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤细胞增殖[13]；④MFN2蛋白活性的增高可增强线粒体融合功能。这均提示MFN2基因与肿瘤的发生、发展过程存在密切联系[14]。

本研究结果显示，膀胱癌组织中MFN2蛋白的阳性表达率明显高于正常膀胱组织（P＜0.01）；膀胱癌组织中MFN2 mRNA的相对表达量明显高于正常膀胱组织（P＜0.01）。提示膀胱癌组织中MFN2基因及蛋白表达上调明显。这可能是由于肿瘤细胞生长需要消耗较多能量，因而需要线粒体不断裂变、聚变并诱导细胞凋亡，而MFN2基因定位线粒体外膜，是介导线粒体融合所必需的蛋白质，可参与内质网的应激反应，因此膀胱癌组织中MFN2基因和蛋白的表达水平明显升高。

本研究结果发现，中低分化、T3期膀胱癌患者的膀胱癌组织中MFN2蛋白的阳性表达率分别高于高分化、T2期的膀胱癌患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄、性别、淋巴结转移膀胱癌患者的膀胱癌组织中MFN2蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），表明MFN2与膀胱癌的发生、发展关系密切。MFN2因细胞阻滞作用而抑制细胞的集落和增殖，进而削弱肿瘤细胞的侵袭和迁徙能力。此外，有研究结果表明，MFN2可上调PARPJI caspsase-3片段并将膀胱癌细胞阻滞于G2/M期，从而诱导肿瘤细胞凋亡[15]。

综上所述，膀胱癌组织中MFN2基因和蛋白的表达上调明显，并且与膀胱癌患者的临床特征有一定的关联。