王利君，王武亮，袁博，王晨阳

郑州大学第二附属医院妇产科，郑州450014

宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤之一，其发病率及病死率在中国均呈上升趋势，其发生及发展是一个多阶段、多基因的过程，研究宫颈癌的发病原因及机制对其诊断和治疗具有重要意义[1]。微RNA（miRNA）是一类由19～25个核苷酸组成的小分子非编码RNA，已有大量研究显示其在细胞增殖、凋亡、分化及肿瘤的发病机制中有重要的调控作用，且一些研究显示miRNA在肿瘤、糖尿病、心血管疾病中发挥重要作用[2-3]。miRNA-143是miRNA家族中的一员，其表达具有肿瘤特异性，在肺癌、前列腺癌中低表达[4]，而在肝癌中高表达[5]。缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）在肿瘤组织中表达广泛，HIF-1α在肿瘤细胞的增殖和迁移及肿瘤血管生成等过程中发挥重要作用[6]，且通过靶基因预测软件预测到miRNA-143与HIF-1α存在靶向关系，但miRNA-143靶向HIF-1α对宫颈癌细胞生物学特性的影响及机制尚不清楚。本研究探讨了miRNA-143与HIF-1α的靶向关系，并研究了影响宫颈癌细胞增殖及凋亡的机制，以期为宫颈癌的诊断及治疗提供理论基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2015年2月至2016年6月于郑州大学第二附属医院存档的50例宫颈癌患者的宫颈癌组织及相应的癌旁组织标本。50例患者中，年龄32～82岁，平均（50.4±9.2）岁。所有患者术前均未行放化疗及其他治疗，且有完整的临床资料。人宫颈癌C-33A、HeLa、CaSki细胞均购自上海斯信生物科技有限公司。

1.2 主要试剂和仪器

胎牛血清、胰酶、青霉素、链霉素、RPMI1640培养基均购自美国Gibco公司；Ki-67、cleaved caspase 3、β-catenin、cyclin D1单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗均购自美国Abcam公司；RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；CCK8试剂盒、BCA试剂盒、Annexin V-FITC凋亡试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；倒置显微镜购自日本Olympus公司；CO2细胞培养箱购自美国西盟公司；酶标仪、电泳凝胶图像分析系统、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.3 细胞培养

采用RPMI1640培养基培养人宫颈癌C-33A、HeLa、CaSki细胞，培养基中加入10%胎牛血清、100 μg/ml链霉素和 100 U/ml青霉素的混合液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞融合度达到80%以上时，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，根据实验需要进行传代培养，待细胞进入对数生长期后即可用于实验。

1.4 不同组织及细胞中miRNA-143表达水平的检测

采用RNA提取试剂盒提取宫颈癌组织、癌旁组织及不同宫颈癌细胞中的总RNA，采用逆转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，采用Oligo 6.0软件设计目的基因miRNA-143及内参基因U6的引物，送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。按照试剂盒说明书设置反应体系及参数，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）检测miRNA-143的表达水平。实验重复3次。

1.5 细胞转染

取生长至对数期的人宫颈癌HeLa细胞，参考Invitrogen公司的脂质体LipofectamineTM2000转染方法分别将miRNA-143 mimics、miRNA-143 inhibitor及HIF-1α-siRNA转染至细胞中（3个实验组），未转染的作为对照组，调整各组细胞浓度为5×104/ml，接种于6孔细胞培养板中，每孔加入2 ml，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞融合度达到30%～50%时用于转染。转染后室温放置20 min，6 h后换成RPMI1640完全培养液继续培养48 h。Western blot检测miRNA-143 mimics组、miRNA-143 inhibitor组和对照组细胞中HIF-1α蛋白的表达水平，实验重复3次。

1.6 荧光素酶活性检测

miRBase（http://mirbase.org/）、TargetScan（http://www.targetscan.org/）、PicTa（http://pictar.mdc-berlin.de/）三大靶基因预测库预测到miRNA-143与HIF-1α的3′-UTR存在结合位点。为了验证miRNA-143与HIF-1α是否存在靶向关系，构建野生型HIF-1α（Wt-HIF-1α）和突变型HIF-1α（Mut-HIF-1α）的3′-UTR荧光素酶报告载体，并进行miRNA-NC+miRNA-143 mimics、Wt-HIF-1α+miRNA-143 mimics、Mut-HIF-1α+miRNA-143 mimics三组共转染，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养48 h，收集细胞，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒的说明检测各组细胞中双荧光素酶的活性。实验重复3次。

1.7 细胞增殖检测

取对照组、miRNA-143 mimics组及 HIF-1α-siRNA组细胞。采用0.25%的胰蛋白酶消化上述3组细胞，调整细胞浓度为 5×103/ml，取 200 μl接种于96孔细胞培养板中，设置6个复孔，48 h后，每孔加入CCK8溶液10 μl，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h。用酶标仪在490 nm波长处测定并记录各组的吸光度A，计算细胞存活率。细胞存活率=（转染组细胞A值/对照组细胞A值）×100%。实验重复3次。

1.8 细胞凋亡检测

采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡。对照组、miRNA-143 mimics组、HIF-1α-siRNA组细胞生长至融合度达80%左右时收集细胞，预冷的磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，离心，弃上清，取1×106个细胞加入100 μl结合缓冲液悬浮细胞，取悬浮液再加入PI和Annexin V-FITC各5 μl，充分混匀后室温避光静置20 min，再加入400 μl结合缓冲液，上机，流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.9 Ki-67、cleaved caspase 3、 β-catenin、cyclin D 1蛋白表达检测

收集培养48 h的对照组、miRNA-143 mimics组、HIF-1α-siRNA组细胞，提取细胞中的蛋白，采用BCA试剂盒对蛋白进行定量，配置12%的分离胶及5%的浓缩胶，将蛋白样品与上样缓冲液按照1∶1的比例混匀，取变性蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离后4℃转印蛋白至PVDF膜上，采用50 g/L的脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗（Ki-67、cleaved caspase 3、β-catenin、cyclin D1、GAPDH，1∶500稀释），4℃孵育过夜，然后加入二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，1∶1000稀释），ECL发光剂显影，自动凝胶成像系统采集图像。以GAPDH作为内参，分析 Ki-67、cleaved caspase 3、β-catenin、cyclin D1的蛋白表达水平。实验重复3次。

1.10 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对-数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-143在宫颈癌组织及细胞中的表达

RT-PCR检测结果显示，宫颈癌组织中miRNA-143的表达水平为（0.892±0.107），明显低于癌旁组织的（6.248±0.735），差异有统计学意义（t=60.29，P＜0.01）。人宫颈癌CaSki细胞中的miRNA-143表达水平高于人宫颈癌HeLa细胞和C-33A细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05），详见表1。

表1 不同宫颈癌细胞中miRNA-143表达水平的比较（±s）

表1 不同宫颈癌细胞中miRNA-143表达水平的比较（±s）

注：*与CaSki细胞比较，P＜0.05

2.2 不同组别HIF- 1 α蛋白表达水平的比较

miRNA-143 mimics组的HIF-1α蛋白表达水平低于对照组，miRNA-143 inhibitor组的HIF-1α蛋白表达水平高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表 2）

表2 不同组别HIF- 1 α蛋白表达水平的比较（±s）

表2 不同组别HIF- 1 α蛋白表达水平的比较（±s）

注：*与对照组比较，P＜0.05

2.3 不同组别荧光素酶活性的比较

Wt-HIF-1α+miRNA-143 mimics组的荧光素酶活性低于miRNA-NC+miRNA-143 mimics组和Mut-HIF-1α+miRNA-143 mimics组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而Mut-HIF-1α+miRNA-143 mimics组与miRNA-NC+miRNA-143 mimics组的荧光素酶活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

表3 不同组别荧光素酶活性的比较（±s）

注：*与Wt-HIF-1α+miRNA-143 mimics组比较，P＜0.05

2.4 不同组别HeLa细胞存活率的比较

miRNA-143 mimics组和HIF-1α-siRNA组的细胞存活率均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表 4）

表4 不同组别HeLa细胞存活率的比较（%±s）

表4 不同组别HeLa细胞存活率的比较（%±s）

注：*与对照组比较，P＜0.05

2.5 不同组别HeLa细胞凋亡率的比较

miRNA-143 mimics组和HIF-1α-siRNA组的细胞凋亡率均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图1、表5）

2.6 不同组别Ki-67、cleaved caspase 3、 βcatenin、cyclin D 1蛋白表达水平的比较

miRNA-143 mimics组和 HIF-1α-siRNA组的Ki-67、β-catenin、cyclin D1蛋白表达水平均低于对照组，cleaved caspase 3蛋白表达水平高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图2、表6）

3 讨论

近些年，miRNA作为重要的基因调控分子，与肿瘤的关系已成为生物学领域的研究热点。作为调控基因表达网络的重要部分，miRNA可参与调控多条信号通路[7]。研究显示，miRNA参与细胞增殖、凋亡、早期发育、脂肪代谢等一系列生命活动的各个进程，在胃癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中均出现异常表达，发挥原癌基因或抑癌基因的作用，其表达上调可通过下调抑癌基因而发挥癌基因的作用，表达下调可通过上调原癌基因而发挥抑癌基因的作用[8-9]。miRNA-143的生物学功能十分广泛，参与牙齿发育、卵泡发育、脂肪代谢等生命活动的各个进程，在不同肿瘤中的表达可能不同，在乳腺癌、胃癌、直肠癌中表达下调，在肝癌中表达上调[10-12]。本研究结果显示，miRNA-143在宫颈癌组织中低表达，说明miRNA-143低表达影响了宫颈癌的发生及发展。

图1 过表达miRNA-143和干扰HIF- 1α 对HeLa细胞凋亡的影响

表5 不同组别HeLa细胞凋亡率的比较（%±s）

表5 不同组别HeLa细胞凋亡率的比较（%±s）

注：*与对照组比较，P＜0.05

miRNA调控疾病的机制可能与其调控的靶基因有关，靶基因预测软件显示HIF-1α是miRNA-143的一个靶基因。HIF-1α是近些年发现的在人体缺氧条件下存在的一种转录因子，在卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤中高表达，影响肿瘤的生长、凋亡、侵袭等过程[13-14]。有研究显示，miRNA-143可靶向HIF-1α，抑制肝癌细胞的增殖并促进其凋亡[15]。为证实miRNA-143靶向HIF-1α对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响，本研究首先证实HIF-1α是miRNA-143的靶基因，细胞增殖及凋亡结果显示，上调miRNA-143及抑制HIF-1α的表达均可抑制宫颈癌细胞增殖并促进其凋亡。

图2 过表达miRNA-143和干扰HIF- 1α 对Ki-67、cleaved caspase 3、β -catenin、cyclin D 1蛋白表达的影响

表6 不同组别Ki-67、cleavedcas pase 3、β -catenin、cyclin D 1蛋白表达水平的比较（±s）

表6 不同组别Ki-67、cleavedcas pase 3、β -catenin、cyclin D 1蛋白表达水平的比较（±s）

注：*与对照组比较，P＜0.05

细胞增殖及凋亡平衡是维持机体正常生长发育所必须的，Ki-67和caspase 3是与细胞增殖和凋亡密切相关的关键基因。Ki-67位于人染色体10q25，是一种与细胞增殖相关的基因，在肿瘤增殖各时期均有表达，参与多种肿瘤细胞的生长、发展及侵袭等过程，目前已作为检测肿瘤的标志物[16]。caspase 3是Caspase家族的关键蛋白，位于caspase级联反应的下游，在受到凋亡信号刺激后被激活，激活后的caspase 3参与胃癌、肺癌等多种肿瘤细胞的凋亡[17-18]。Wnt信号通路是一条在进化上相对保守的信号途径，参与细胞增殖、分化、个体发育、凋亡等过程，Wnt/β-catenin是一条经典的Wnt信号通路，与肿瘤发生、衰老和退化、骨质疏松等疾病有关，其激活可导致宫颈癌、肺癌等多种肿瘤的发生，也有研究显示阻断该信号通路可抑制肿瘤的发生及发展[19-21]。本研究结果显示，上调miRNA-143的表达及抑制HIF-1α的表达后，可使Ki-67、β-catenin、cyclin D1蛋白的表达水平降低，cleaved caspase 3蛋白的表达水平升高。

综上所述，miRNA-143可通过靶向HIF-1α抑制Wnt/β-catenin信号通路，抑制宫颈癌细胞增殖并促进细胞凋亡，可为宫颈癌的诊断及治疗提供新的策略及靶点。