★ 祝婧云 汤涛 廖正根 赵国巍 梁新丽*

(1.南昌大学第四附属医院药学部 南昌 330003；2.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004)

欧前胡素是一种线性呋喃香豆素类天然活性成分，主要来源于中药白芷、欧前胡、蛇床、独活、北沙参、当归等植物。欧前胡素不仅在治疗心血管疾病、抗菌、抗病毒等方面具有显著意义[1]，并且有研究表明欧前胡素能够通过靶向于Mcl-1蛋白来诱导肿瘤细胞的凋亡来从而发挥抗肿瘤的作用以及逆转肿瘤细胞的多药耐药[2-7]。提示欧前胡素是一种潜在的抗肿瘤药物，具有良好的应用前景。

近年来，处方前的研究在新药的剂型设计和老药的剂型改进方面已经逐渐成为一种常规化的研究项目[8]。药物的亲脂性或疏水性与药物在细胞膜上的渗透性相关，而油水分配系数和平衡溶解度又是反映药物脂溶性的2个重要理化性质参数，这2 个重要理化性质参数对研究药物在体内过程以及指导临床用药具有十分重要的意义[9]。目前，国内外尚无测定欧前胡素的平衡溶解度、表观油水分配系数及其影响因素试验的文献报道，本文通过测定欧前胡素的平衡溶解度、表观油水分配系数及其在高温(60℃)、光照(4500±500 Lx)条件下稳定性来进行处方前研究，以期为欧前胡素注射用脂微球的剂型设计奠定基础。

1 材料

欧前胡素对照品(中国食品药品检定研究院，批号110826-200712);欧前胡素(西安昊轩生物科技有限公司);甲醇(上海振兴化工一厂，色谱纯);正辛醇(上海化学试剂公司，分析纯);注射用大豆油(LCT铁岭北亚药用油有限公司，批号y11030103-2-01);注射用中链脂肪酸甘油脂(MCT Lipoid，批号940031);其他试剂都为分析纯。

Agilent1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司);UV2100PC 型紫外分光光度计(尤尼科上海仪器有限责任公司);TG328A十万分之一电子天平(德国Startorius公司);QYC-200型全温空气摇床(上海福玛实验设备有限公司);高速冷冻离心机(德国SIGMA公司);Millipore Synergy超纯水系统(美国密理博公司)。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

2.1.1 正辛醇水饱和液的制备 精密吸取100 mL的正辛醇溶液置于250 mL的具塞锥形瓶中，加超纯水100 mL，放入空气恒温摇床上，控制温度为(25±1)℃，转速为100 r/min，振摇24 h，静置，备用。

2.1.2 不同pH缓冲液的制备 按照2015版《中国药典》第三部试剂试液标准品8004缓冲液的配制方法，分别精密配置pH为2.0，4.0，6.0，7.4，8.0，9.0的缓冲液[10]。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取欧前胡素对照品约5.0 mg，加甲醇定容至10 mL的棕色容量瓶中。精密量取200 μL置10 mL棕色容量瓶，加甲醇定容至刻度，摇匀，配制成10μg/mL的对照品溶液。

2.2 欧前胡素的含量测定

2.2.1 检测波长的选择 取欧前胡素对照品溶液，以甲醇为空白对照，采用紫外分光光度法在190～400nm的波长范围内进行全波长扫描，结果显示欧前胡素在300 nm处有最大吸收波长，因此选择300nm作为欧前胡素的检测波长。

2.2.2 色谱条件 Agilent1260，Phenomenex-C18柱(5μm，250 mm×4.6 mm)，流动相甲醇-水(80∶20)，流速1.0 mL/min，柱温25℃，紫外检测波长300nm，进样量20 μL。

2.2.3 专属性试验 按照2.2.2项下液质条件检测，见图1。结果显示阴性无干扰。

A.欧前胡素对照品;B.空白脂微球;C.欧前胡素脂微球

2.2.4 方法学的建立 精密称取欧前胡素对照品5mg，置10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，制得0.5mg/mL的储备液。精密量取储备液适量用甲醇稀释，配成1、5、10、15、20、25 μg/mL系列对照品溶液。按2.2.2项下的色谱条件进行测定，分别记录欧前胡素的峰面积。以进样浓度(X) 为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标作图并进行线性回归，得线性方程为Y=199.73X-177.41，r=0.9995(n=6)，结果表明欧前胡素在进样质量浓度1～25μg/mL时呈良好线性关系。采用逐级稀释法，测定欧前胡素的定量限限为66ng/mL(S/N=11.4)。高、中、低3个质量浓度的回收率在99.20%～101.75%之间，平均回收率为100.12%，RSD均值为0.77%。精密度RSD为0.12%。

2.2.5 稳定性考察 将对照品储备液分别在0、2、4、6、8、10、12、24h，取样按照2.2.1项下的色谱条件进行进样，计录峰面积(A)，经计算其RSD为0.87%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.3 欧前胡素平衡溶解度的测定

2.3.1 不同pH值缓冲液中的表观溶解度 精密称取过量的欧前胡素分别加至pH为2.0，4.0，6.0，7.4，8.0，9.0的5mL的缓冲液中，置于空气恒温摇床上，控制温度为(25±1)℃，转速为100 r/min，振摇72 h，0.22 μm微孔滤膜过滤后，按上述色谱条件进样20 μL，记录峰面积，计算欧前胡素在不同pH缓冲液中的含量，并计算其在不同pH缓冲液中的平衡溶解度，结果分别为0.36，2.45，1.14，2.45，2.66，2.52μg/mL，表明欧前胡素在不同pH缓冲液的溶解度都相对较低，提示欧前胡素水溶性差。

2.3.2 LCT∶MCT不同比例下在油相中的溶解度 精密称取0.5g的欧前胡素，按表2中MCT和LCT的不同比例，精密称取油相6 g，置于空气恒温摇床(25 ℃，100 r/min)，振摇72 h，用0.22 μm微孔滤膜过滤。精密称取0.4 g，置于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度。按“2.2.2”项下液相色谱条件，进行含量测定。结果表1。欧前胡素在注射用油中的溶解度随着MCT比例的增加，溶解度也一直增大。欧前胡素在MCT中的溶解度最大，为26.3 mg/g。

表1 欧前胡素在LCT∶MCT不同比例油相中的溶解度 mg/g

2.4 表观油水分配系数的测定 精密称取欧前胡素对照品25 mg，置于50 mL水饱和的正辛醇溶液中，超声溶解，以4000 r/min的转速离心15 min，备用。精密吸取含欧前胡素的水饱和正辛醇2 mL，置于10 mL离心管中，分别加入2 mL正辛醇饱和的水及不同pH的缓冲液，将离心管封口后放入空气恒温摇床上，控制温度为(25±1)℃，转速为100r/min，振摇72 h直至平衡。4000 r/min离心15 min后，取上层正辛醇溶液0.5mL定容至10mL容量瓶中。按照上述2.2.2项下色谱条件进样20 μL进行测定，记录峰面积，按照外标法计算出油相中欧前胡素的浓度Co，然后计算油水分配系数Papp值。计算公式如下：

Papp=CoVo/ C1V- CoVo

上式中Papp为欧前胡素的表观油水分配系数，C1为正辛醇中欧前胡素的初始药物浓度(μg/mL)，V为水饱和正辛醇的体积(即2.0 mL)，Co为分配平衡时欧前胡素在油相中测得的浓度(μg/mL)，Vo为油相体积(即2.0 mL)，C1-Co为分配平衡时欧前胡素在水相中的浓度(μg/mL)。

按照上述公式计算在不同pH缓冲液溶液中欧前胡素的表观油水分配系数。结果显示，欧前胡素在水中的表观油水分配系数为16.76(logP=1.22)，在正辛醇-缓冲液中的表观油水分配系数见表2。表2表明欧前胡素在正辛醇-缓冲液中的表观油水分配系数中受pH的影响不大。

表2 欧前胡素在不同pH值下的油水分配系数

2.5 欧前胡素的影响因素试验考察 按照2015版《中国药典》第四部通则中9001原料药物与制剂稳定性试验指导原则，进行欧前胡素原料药的影响因素试验[11]。以欧前胡素的含量测定为评价指标，考察光照、温度对欧前胡素的变化影响。

2.5.1 光照对欧前胡素溶液的影响 精密称取欧前胡素5.0 mg，置于10mL的容量瓶中，配制成0.5 mg/mL的储备液，光照设为4500±500 Lx，分别于0、1、5、10天取0.2 mL并用甲醇稀释成10 μg/mL溶液。按照上述2.2.2项下色谱条件进样20 μL进行测定浓度。结果见表3。欧前胡素在强光光照条件下，连续10天的降解率未超过10%，说明欧前胡素溶液在光照条件下相对比较稳定。

表3 强光对欧前胡素含量的影响

2.5.2 高温对欧前胡素溶液的影响 精密称取欧前胡素5.0mg，置于10 mL的容量瓶中，配制成0.5 mg/mL的储备液，于60℃下放置10天。分别于0、1、5、10天取0.2 mL并用甲醇稀释成10 μg/mL溶液。按照上述2.2.2项下色谱条件进样20 μL进行测定浓度。结果见表4。欧前胡素在60℃高温下，第一天含量降解率为3.8%，连续10天的降解率为19.9%，说明欧前胡素在高温条件下不是很稳定，提示欧前胡素及其制剂必须低温或者常温保存。

表4 高温对欧前胡素含量的影响

3 讨论

本实验用HPLC首次测定了欧前胡素的表观溶解度及其油水分配系数，以期为欧前胡素注射用脂微球的剂型设计奠定基础。通过欧前胡素的化学结构式可知其是线性呋喃香豆素类化合物，具有烯丙醚和酯键，故选择在不同消化道的生理pH值区间范围内的缓冲液作为溶剂来测定其表观溶解度。通过测定25℃时欧前胡素在不同pH缓冲液下的表观溶解度，得知欧前胡素水溶性差；在不同的LCT/MCT油相比例下，发现欧前胡素的溶解度随着MCT的增加逐渐增加，在MCT中溶解度为26.3 mg/g，说明欧前胡素在注射用油中有相对较高的溶解度，提示能将欧前胡素做成注射用脂质微球的可能。

目前，油水分配系数的测定方法主要包括摇瓶法、产生柱法和高效液相色谱法[12-14]。但是，由于产生柱法的测定过程繁琐且平衡时间太长，反向高效液相色谱法也需要使用已知Papp值的同系物作为对照品来建立标准曲线且费用昂贵，而经典的摇瓶法不仅操作简单而且成本低，因此本实验中我们采用了摇瓶法来检测欧前胡素的油水分配系数。正辛醇溶液的溶解度参数与生物膜的溶解度参数一致，均为21.07 MPa1/2，故选用正辛醇来模拟生物膜，对药物的透过性有一定的参考依据[15]。根据文献报道，药物吸收的最佳范围是-1

本实验中参照2015版《中国药典》在光照(4500±500 Lx)和高温(60 ℃)条件下对欧前胡素的稳定性进行考察,发现欧前胡素在光照下相对稳定，但应该在低温或者常温下保存。

药物的理化参数(如溶解度、油水分配系数以及在不同的环境中药物的稳定性等)直接影响着药物的生物利用度。本实验通过对欧前胡素进行一个较为系统的处方前研究，以期为制备成注射用脂微球的处方设计以及工艺优化等提供实验依据。

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