实验室检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的控制点分析

2018-06-20石晓丽包头市食品药品检验检测中心

食品安全导刊 2018年15期

□ 石晓丽段羚包头市食品药品检验检测中心

单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）（简称单增李斯特菌，下文以“L.M”表示）是一种常见的土壤细菌，是李斯特菌中唯一能引起人类疾病的细菌。对于某些食物（比如乳制品和肉制品），其是一种污染菌，能引起食物变质。本文在严格按照GB4789.30-2016中规定的流程进行操作的基础上，根据多次阳性对照实验、阴性对照实验以及能力验证实验，总结出食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测的几个关键控制点。

1 实验准备

用胰酪胨大豆肉汤分别活化菌种编号为CICC21633的单核细胞增生李斯特氏菌和菌种编号为CICC10297的无害李斯特氏菌。

2 检验方法

依据GB4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》第二法，依据单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法进行检验，程序见图1。

图1 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法检验流程

3 检验步骤

首先，取25.0mL无菌纯牛奶于均质袋中，分别吸取已用胰酪胨大豆肉汤活化过的24 h的菌种编号为CICC21633的单核细胞增生李斯特氏菌和菌种编号为CICC10297的无害李斯特氏菌各100 μL加入牛奶中（试样编号①），再加225 mL无添加剂的LB肉汤于均质袋中，在排击式均质器中连续拍击1 min，制成1:10的均液。

其次，分别再取2份25.0 mL无菌纯牛奶，分别加入菌种编号为CICC21633的单核细胞增生李斯特氏菌100 μL（试样编号②）和菌种编号为CICC10297的无害李斯特氏菌100 μL（试样编号③），再分别加225 mL无添加剂的LB肉汤于均质袋中，在排击式均质器连续拍击1 min，分别制成1:10的均液。

最后，将制成的3份1:10均液试样，经过相同的逐级稀释后，每个稀释度分别吸取1 mL以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色平板涂布，在36℃中培养。

4 实验中的对比

4.1 培养基配制方式对比

配制LB1、LB2过程中，需要加入吖啶黄，但吖啶黄本身会产生荧光，且较难清洗完全。为避免由于瓶子残留荧光造成一些需要检测荧光反应的菌种（比如铜绿假单胞菌、饮用水中的大肠埃希氏菌）出现假阳性，所以封装LB1、LB2的瓶子需要单独使用、单独存放、标记明确，不与其他装培养基的瓶子混用。

配制单增李斯特氏菌显色培养基时，将增补剂分成两份，进行区别溶解。第一份直接溶解后加入到46℃左右的科玛嘉李斯特菌显色培养基基础中，编号培养基Ⅰ；第二份溶解后用磁力搅拌器快速搅拌均匀（以1 000 rpm搅拌30 min），使其完全溶解，在成为奶油状的匀质溶液后加入到46℃左右的科玛嘉李斯特菌显色培养基基础中，编号培养基Ⅱ。对比只针对②试样的培养后状态进行，对比见表1。

由此可得出结论，增补剂在溶解后必须用磁力搅拌器快速搅拌均匀（1 000 rpm），而且用时要在30 min以上，使其完全溶解成奶油状的匀质溶液后再加入到46℃左右的科玛嘉李斯特菌显色培养基基础中。

4.2 培养时间对比

培养时间对比见表2。

由此得出结论，培养时间对于观察L.M的结果影响较大。观察太早，菌落形态不能完全展现，晕圈不清晰，不容易观察；观察太晚，菌落形态老化，晕圈严重淡化，容易遗漏，甚至误判。

4.3 纯化使用的培养基对比

纯化使用培养基对比见表3。

由此得出结论，纯化细菌，TSA不是全能的，对于L.M来说，还需要加酵母粉，含0.6%酵母成分的TSAYE纯化L.M效果显著。

5 结语

本次实验对L.M进行多次的阳性对照实验、阴性对照实验以及能力验证实验，同时对培养基配制方式、培养时间、纯化使用培养基进行对比，总结出食品检验L.M过程中的几个控制点：一是增补剂溶解时间必须大于30 min；二是选择观察结果的培养时间要适宜；三是L.M的纯化，要选择配料成分中含有0.6%酵母成分的TSA-YE。