孙益荣吴 敬宿玲恰

(1. 江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2. 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；3. 江南大学教育部食品安全国际合作联合实验室，江苏 无锡 214122)

角质酶是一种多功能水解酶，可用于水解短链或长链脂肪酸酯类和甘油三酯，也可用于降解植物的多聚体角质[1-2]。相较于普通的脂肪酶，角质酶缺少了盖子结构，更易于降解聚酯。基于以上功能特点，角质酶在食品加工和纺织工业等方面具有广泛的应用前景[3-6]，尤其在棉织物的生物精炼和人造纤维的表面改性中，角质酶有望替代传统的化学碱处理，对环境保护有重要意义。

目前角质酶的主要来源包括微生物和花粉2种，其中微生物来源又可细分为致病真菌、部分细菌和少数放线菌三部分[7]。国内外的研究早期集中在植物病原真菌Fusariumsolanipisi[8]、Pyrenopezizabrassicae[9]来源的角质酶上，后续又筛选得到放线菌Thermobifidafusca[1]、Streptomycesacidiscabies[3]和细菌Pseudomonasputida[10]等产角质酶菌株。绝大多数角质酶，诸如ThermobifidaFusca角质酶，适用温度范围为30～60 ℃。而特异腐质霉(Humicolainsolens，H.insolens)角质酶最适温度为80 ℃，并有良好的耐热性。在此应用温度下，棉纤维表层的蜡质会因高温融化，有利于角质酶与角质的结合，提升酶应用效能。因此，特异腐质霉来源的角质酶具有更好的应用前景。为了更好地生产角质酶，构建工程菌生产重组蛋白是目前研究的主要方式。因而选择合适的表达宿主显得尤为重要。大肠杆菌表达系统作为目前研究最深入、开发最成熟的一种表达系统，具有培养周期短、表达效率高、遗传相对稳定、操作相对简便的特点[11]，是生产异源蛋白最常用的系统之一。

本试验拟将Humicolainsolens来源的角质酶基因在大肠杆菌中进行克隆表达，测定其酶学性质，并在3 L发酵罐的水平上进行扩大培养及条件优化，为H.insolens角质酶在工业中的应用及后续的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株与质粒

H.insolens角质酶基因、克隆宿主E.coliJM109、表达宿主E.coliBL21(DE3)、表达载体pET 20b(+)：作者所在实验室保藏；

克隆载体pMD18-T simple vector：宝生物工程(大连)有限公司；

PCR引物：生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.2 主要试剂

DNA Marker、琼脂糖、T4DNA连接酶、限制性内切酶NcoI和Hind III、碱性磷酸酶(CIAP)及PCR聚合酶PrimeSTAR：宝生物(大连)工程有限公司；

氨苄青霉素(Amp)：分析纯，生工生物(上海)工程有限公司；

异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)：分析纯，阿拉丁生化(上海)科技有限公司；

普通DNA产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒：天根生化(上海)科技有限公司；

分子级胰蛋白胨和酵母粉：英国Oxoid公司；

蛋白分子量标准品、蛋白质凝胶电泳试剂盒：碧云天(上海)生物科技有限公司；

其它试剂：分析纯，国药集团(上海)化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

LB培养基：胰蛋白胨 10.0 g/L、酵母粉 5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L；

TB培养基：甘油 5.0 g/L、胰蛋白胨 12.0 g/L、酵母粉 24.0 g/L、K2HPO4·3H2O 16.43 g/L、KH2PO42.35 g/L；

3 L罐发酵培养基：工业级蛋白胨 1.2 g/L、工业级酵母粉 2.4 g/L、甘油 8.0 g/L、KH2PO413.5 g/L、(NH4)2HPO44.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.4 g/L、柠檬酸 1.7 g/L、微量元素液10 mL，用氨水(氢氧化铵)调pH 7.0；

3 L罐补料培养基：工业级蛋白胨 2.4 g/L、工业级酵母粉 4.8 g/L、MgSO4·7H2O 18.35 g/L、甘油600.0 g/L；

微量元素液：Al2(SO4)3·18H2O 2.0 g/L、CoSO4·7H2O 0.75 g/L、H3BO30.5 g/L、MnSO4·7H2O 24.0 g/L、Na2MoO43.0 g/L、NiSO4·6H2O 3.0 g/L、ZnSO4·7H2O 1.0 g/L。

1.2 试验方法

1.2.1 大肠杆菌表达质粒的构建 设计带有酶切位点NcoI 和Hind III的引物，使用PCR仪扩增特异腐质霉角质酶对pET20b(+)载体使用NcoI、Hind III双酶切，CIAP处理防止载体自连，胶回收后获得线性化的载体。在T4 ligase体系下将基因同载体连接过夜，转化JM109感受态细胞，经氨苄青霉素抗性平板筛选，获得阳性转化子。对获得的转化子提质粒，经NcoI、Hind III双酶切验证正确，即质粒pET20b(+)/HIC。质粒由生工生物工程(上海)有限公司测序。将验证正确的质粒pET20b(+)/HIC转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，经氨苄青霉素抗性平板筛选和LB/AMP培养基培养后，使用浓度为15%的甘油管保藏菌种，于-80 ℃冷冻保藏。

1.2.2 重组菌诱导表达 取保藏的特异腐质霉角质酶重组菌接种于LB/AMP培养基中，37 ℃、150 r/min震荡培养8 h后，转接至TB培养基中，接种体积分数5%；37 ℃、150 r/min培养至OD600约为1.5时，加入终浓度为0.05 mmol/L的IPTG，于25 ℃、150 r/min条件下培养24 h左右，直至发酵液中的角质酶酶活不再增高。

1.2.3 SDS-PAGE凝胶电泳检测 洗净并组装制胶装置，用水检漏，确保装置不漏水。依据试剂盒配方配置分离胶，混匀后加入到装置内，用水液封。于37 ℃烘箱静置30 min，待分离胶凝固后用滤纸除去装置中残留的水。配置浓缩胶，加入到槽内，插入梳子，室温下等待浓缩胶凝固。取1 mL发酵液12 000 r/min离心10 min，取上清液20 μL和5 μL的上样缓冲液混匀，沸水浴10 min，上样8 μL。设置电泳仪电压300 V，电流60 mA，运行20 min左右，当蓝色条带到达凝胶底部时停止。轻轻地将凝胶与制胶板分开，剥下的胶用考马斯亮蓝染液染色45 min左右。按照水、乙醇、冰乙酸16∶1∶3的比例配置脱色液，用于蛋白胶脱色，约12～20 h可脱色完全。

1.2.4 酶活力测定方法ρNPB水解酶活性：在37 ℃下，使用连续分光光度法测定酶活力。反应总体积为1.5 mL，包括30 μL 50 mmol/L对硝基苯丁酸酯(ρNPB)的底物，30 μL酶液，和1 440 μL Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。在405 nm波长下，记录对硝基酚的增长速率，反应时间1 min。酶活定义：37 ℃下，每分钟将对硝基苯丁酸酯(ρNPB)催化水解生成1 μmol 对硝基酚的酶量，即为一个酶活力单位(U)。

1.2.5 重组菌最适温度及最适pH测定

(1) 最适温度：分别在不同温度条件下测定同等量的角质酶活力，最高酶活力定义为100%，计算不同温度条件下的相对酶活，探究最适温度。

(2) 最适pH：在不同pH条件下(pH 5.0～10.0)测定等量酶液的酶活，定义最高酶活为100%，计算不同条件下角质酶的相对酶活，探究最适pH。

(3) 缓冲体系为：Na2HPO4-NaH2PO4缓冲体系(5.0～7.0) 、Tris-HCl缓冲体系(pH 7.0～9.0)和Gly-NaOH缓冲体系(pH 9.0～10.0)。

1.2.6 重组菌温度稳定性及pH稳定性测定

(1) 温度稳定性：取同等量的酶液，分别置于60，80 ℃ 的水浴锅中保温处理，60 ℃样品间隔120 min取样一次，80 ℃ 样品间隔5 min取样一次，测定样品酶活力。定义0 h样品的酶活为最高酶活100%，计算角质酶残留酶活在不同温度下随时间的变化情况，探究该酶的温度稳定性。

(2) pH稳定性：取不同pH值(pH 5.0～10.0)条件下的酶液，于室温静置48 h，取等量酶液测定酶活，最高酶活定义为100%，计算不同pH条件下的角质酶残留酶活变化情况，探究角质酶的pH稳定性。缓冲体系同1.2.5(3)。

1.2.7 3 L发酵罐扩大培养 将保藏的甘油管，以2%的接种体积分数转接至50 mL工业级LB培养基中，并添加终浓度为0.1 g/L的氨苄青霉素，37 ℃、200 r/min培养8 h。取上述种子以10%的接种体积分数，转接至3 L NBS BioFlo-115型发酵罐中，起始装液量为1 L(包括900 mL的3 L罐发酵培养基和100 mL种子)。维持生长温度37 ℃、溶氧30%，通过补加氨水的方式维持pH 7.0。培养5～7 h后，上罐培养基中的碳源耗尽，溶氧反弹。此后以指数流加的方式向发酵罐中加入补料培养基至发酵结束，比生长速率控制在μ=0.18 h-1。补料阶段6～8 h，在菌体生长至特定OD后进入乳糖诱导阶段，恒速流加0.2 g/(L·h)的乳糖溶液，诱导时间、诱导温度由对应的发酵策略决定。诱导后，间隔一定时间取样，测定样品的菌浓(OD600)和酶活，当酶活出现显著下降趋势后结束发酵。

2 结果与分析

2.1 重组表达质粒的构建

设计带有酶切位点NcoI 和Hind III的引物，使用PCR仪克隆并扩增目的基因HIC。同pET20b(+)载体连接后，转入JM109感受态细胞，经氨苄青霉素抗性平板筛选，获得阳性转化子。对获得的转化子提质粒，NcoI、Hind III双酶切验证，结果见图1。从图1可知，600 bp处出现目的条带，与H.insolens角质酶基因的理论大小相符，重组质粒pET20b(+)/HIC构建完成。

2.2 重组角质酶在大肠杆菌中的表达

将构建完成的重组质粒 pET20b(+)/HIC转入BL21(DE3)感受态细胞，经氨苄青霉素抗性平板筛选，获得阳性转化子。将转化子转接至摇瓶中，依据1.2.2所述方法进行诱导表达，24 h酶活达到最大值，此后保持稳定，据此结束发酵。发酵液中的胞外酶活为170 U/mL、胞内酶活<1 U/mL，总酶活170 U/mL。发酵上清液的蛋白电泳图见图2。从图2可知，20 kDa处有明显的条带，与HIC的理论相对分子质量一致，表明H.insolens来源的角质酶基因HIC已在大肠杆菌中正确表达。

M. DNA Marker 1. 质粒pET20b(+)/HIC经NcoI/HindIII双酶切后的条带

图1 重组质粒pET20b(+)/HICNcoI、Hind III双酶切电泳图

Figure 1 Restriction enzyme digestion analysis of pET20b(+)/HIC

M. 蛋白质分子量标准(高) 1.H.insolens角质酶重组菌发酵培养基上清液组分

图2 重组菌摇瓶发酵胞外上清液SDS-PAGE分析

Figure 2 SDS-PAGE analysis of culture supernatant of recombinant strains

2.3 重组角质酶的酶学性质

2.3.1 最适pH和pH稳定性 从图3(a)可知，伴随pH值的改变，重组角质酶酶活出现明显变化，pH处于5.0～8.5时，相对酶活逐渐上升；pH处于8.5～10.0时，相对酶活逐渐降低；说明重组酶最适pH值为8.5。从图3(b)可知，pH 5.0～10.0时，放置48 h酶活几乎无变化。

2.3.2 最适温度和温度稳定性 从图4(a)可知，30～80 ℃时，相对酶活呈逐渐上升趋势；80～85 ℃时，相对酶活逐渐下降，说明重组酶的最适反应温度为80 ℃。从图4(b)、(c)可知，重组角质酶80 ℃条件下的温度半衰期为11 min，60 ℃ 条件下温度半衰期为14 h。

2.4 重组角质酶在3 L发酵罐中的发酵优化

2.4.1 诱导时间对高密度发酵的影响 重组菌于3 L罐发酵过程中，诱导时间会显著地影响到菌体浓度和异源蛋白的表达量。诱导时间过早，会对宿主菌的生长造成负担，降低细胞生长速率，影响到异源蛋白的正常表达。诱导时间过晚，会导致诱导强度不足，最终影响到蛋白表达量[12]。为探求最佳的诱导时间，获得最高的重组角质酶蛋白表达量，本研究中统一控制发酵罐诱导温度为30 ℃、乳糖浓度为0.2 g/(L·h)，分别在菌浓OD600为30，40，50，65时开始恒速流加乳糖溶液，测定各诱导阶段的菌体生长情况和蛋白表达情况，结果见图5。

图3 重组角质酶的最适pH和pH稳定性

图4 重组角质酶的最适温度和温度稳定性

图5 诱导时间对重组菌生长和产酶的影响

从图5可知，当菌体浓度OD600为30时开始乳糖诱导，菌体生长和蛋白表达受到显著影响，最终导致重组菌于OD600为82时即停止生长，其最高酶活仅为1 766 U/mL；当菌体浓度OD600为40时开始乳糖诱导，菌体最终生物量(OD600)和蛋白表达情况亦受到一定影响，重组菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC的最高酶活为2 150 U/mL；当菌体浓度OD600为50时开始乳糖诱导，菌体生长状况良好，蛋白正常表达，重组菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC的最高酶活为2 233 U/mL；当菌体浓度OD600为65时开始乳糖诱导，OD600为100后菌体生物量达到最高，此后逐渐下降，重组菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC的最高酶活为1 934 U/mL。OD600为50时诱导的菌体生长及蛋白表达情况均优于OD600为30，40，65时诱导的，故本研究认为OD600为50时进行诱导为最佳诱导时间。

2.4.2 诱导温度对高密度发酵的影响 诱导温度是影响菌体生长和重组蛋白产量的因素之一。温度较低时菌体生长速率降低，菌体浓度低，进而影响重组蛋白的表达；温度过高，细胞内多肽链合成速度加快，当合成速率大于折叠速率后，会造成多肽链聚集而无法正确折叠，最终以不溶性包涵体的形式沉积。故选择最合适的诱导温度，对提高重组菌株在3 L发酵罐中的产酶量有重要意义。

依据2.4.1的试验结果，当菌体浓度OD600达到50后进入诱导阶段，此时分别选择3种不同的温度(25，30，35 ℃)，统一恒速流加[0.2 g/(L·h)]乳糖溶液进行诱导，以测定不同诱导温度对重组蛋白表达的影响，结果见图6。从图6可知，当诱导温度为25 ℃时，菌体生长缓慢，菌体生物量OD600为84时即停止生长，蛋白表达亦受到抑制，重组菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC最高酶活为1 565 U/mL，为3种温度下的最低值。当诱导温度为30 ℃时，菌体生物量OD600最高为104，重组菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC最高酶活为2 233 U/mL。当诱导温度为35 ℃时，菌体生长情况最好，菌体生物量OD600最高达到114，但是重组菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC最高酶活仅为1 772 U/mL，明显低于30 ℃时的，其原因可能是过高的温度和过快的菌体生长速度，导致蛋白不正常折叠形成大量没有活性的包涵体，故认为30 ℃为最佳诱导温度。

图6 诱导温度对重组菌生长和产酶的影响

3 结论

角质酶可有效降解棉纤维表层角质，增强纤维润湿性，在纺织工业中有很好的应用前景。但是，工业中处理棉纤维的常用方法，均需在高温环境下进行才能保证处理效果。而目前已报到的角质酶基因来源，催化温度偏低，在实际使用时需多次改变温度、工艺复杂，工业化应用受到了明显的限制。本试验为解决上述问题，尝试在E.coli中重组表达了H.insolens来源的角质酶基因，重组后的角质酶最适温度高达80 ℃，在高温应用环境下可保持一段时间的稳定。进一步将重组酶在3 L罐中进行发酵优化，确定了重组酶的最佳诱导温度为30 ℃，菌体浓度OD600为50时进行诱导为最佳诱导时间，获得的最高酶活可达2 233 U/mL。本研究可为角质酶在棉织物精练工业中的应用提供新的研究思路，而且简化工艺流程、降低生产成本。

但由于本试验在3 L罐中的发酵罐数较少，存在优化不彻底的问题，重组酶的表达仍处于较低水平。因此，在后续研究中，应围绕诱导强度和重组蛋白表达量之间的关系进一步优化发酵工艺。其次，在优化过程中，还应考虑到该角质酶具有磷脂水解活性的特点，在重组菌发酵过程中可能会对宿主细胞膜造成损伤，因而发酵过程中平衡诱导强度、菌体浓度及蛋白表达量之间的关系也是十分关键的。如果能很好地解决上述问题，获得更好的蛋白表达及更短的发酵周期，将会对降低角质酶生产成本有重要的意义。

[1] CHEN Sheng, TONG Xing, WOODARD R W, et al. Identification and characterization of bacterial cutinase[J]. J Biol Chem, 2008, 283(38): 25 854-25 862.

[2] 李江华, 刘龙, 陈晟, 等. 角质酶的研究进展[J]. 生物工程学报, 2009, 25(12): 1 829-1 837.

[3] FETT W F, GÉRARD H C, MOREAU R A. Cutinase production byStreptomycesspp[J]. Curr Microbiol, 1992, 25(3): 165-171.

[4] JOHAN S. Laundry detergent and/or fabric care compositions comprising a modified transferase: US, 6410498[P]. 2002-06-25.

[5] CHEN Sheng, SU Ling-qia, CHEN Jian, et al. Cutinase: characteristics, preparation, and application[J]. Biotechnology Advances, 2013, 31(8): 1 754-1 767.

[6] LOOMER S, ADLERCREUTZ P, MATTIASSON B. Triglyceride interesterification by lipases 1: Cocoa butter equivalents from a fraction of palm oil[J]. J Am Oil Chem Soc, 1990, 67: 519-524.

[7] KOLATTUKKUDY P E P R E, MAITI I B. Cutinases from fungi and pollen[J]. Methods Enzymol, 1981, 71(81): 652-664.

[8] MANDY A M A H, WOLFGANG Z. Cutinase production byFusariumoxysporumin liquid medium using central composite design[J]. Biotechnol Lett, 2006, 28(1): 681-685.

[9] LI Dong, ASHBY A M, JOHNSTONE K. Molecular evidence that the extracellular cutinase Pbc1 is required for pathogenicity ofPyrenopezizabrassicaeon oil seed rape[J]. Mol Plant Microbe Interact, 2003, 16(6): 545-552.

[10] SEBASTIAN J C A K, KOLATTUKKUDY P E. Discovery of a cutinase-producingPseudomonassp. cohabiting with an apparently nitrogen-fixingCorynebacteriumsp. in the phyllosphere[J]. J Bacteriol, 1987, 169(1): 131-136.

[11] CORREA A, OPPEZZO P. Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins inE.coli: advantages of high-throughput screening[J]. Biotechnol J., 2011, 6(6): 715-730.

[12] 姜琪, 宿玲恰, 吴敬, 等. 共表达磷脂酶 C 促进葡萄糖异构酶在大肠杆菌中的胞外表达[J]. 食品与生物技术学报, 2017, 36(3): 236-242.