张延平 姜春丽 蒋兴旺 李丽娜 宋徽 刘金伟 于丽玫

老年性聋（presbycusis）或年龄相关性听力下降(age-related hearing loss)是人体老化过程在听觉器官中的表现[1]。随着人口老龄化的加重，老年性耳聋发病率不断增加，据统计，世界上每3个65岁以上成年人中就有一个患有听力障碍，在60～74岁的老年人中，老年性耳聋的病例高达30%～50%[2]。听力障碍严重影响老年人的生活质量，因此，老年性耳聋的防治已经成为研究的热点。目前认为老年性耳聋属于多基因病范畴，具有高度的异质性，是遗传和环境因素共同作用的结果，个体遗传背景在一定程度上决定了老年性耳聋表型的差异[3，4]，不同的遗传背景代表了不同的遗传易感性，如何判断老年性耳聋易感个体成为研究者关注的问题。目前针对老年性耳聋遗传易感性分子机制的研究较少，进展相对缓慢。本文应用弱阳离子磁珠和MALDI-TOF/TOFMS技术筛选并鉴定老年性耳聋易感个体血清差异蛋白，初步探讨了老年性耳聋易感个体血清差异蛋白表达情况，为进一步研究老年性耳聋易感个体的发生机制和筛选提供实验数据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 收集解放军第309医院眼科及耳鼻喉科2015年1月～2015年11月非耳科疾病住院患者78例。纳入标准：①年龄大于或等于60岁；②排除传染病史、中耳炎疾病史、耳毒性药物服用史、遗传性耳聋、突发性耳聋、噪声性耳聋病史；③排除脑血管意外、阿尔兹海默病等严重全身疾病。行全身查体、专科检查及纯音测听检查，空腹抽取静脉血，分离血清，-80℃保存备用。

1.1.2 主要仪器及试剂 MALDI-TOF质谱仪(德国Bruker公司)及自带的BioExplorer软件(德国Bruker公司)，磁力架（磁珠分离器）(德国Bruker公司)，磁珠试剂盒(SB-WCX)以及缓冲液体系（德国布鲁克.道尔顿公司），NanoAcuity超高压纳升级液相色谱（Waters公司），LTQ-Qrbitrap质谱仪 （Thermo Scientific公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 Z值的计算 选取符合上述纳入标准的患者，使用纯音测听仪（丹麦，Madsen VOYAGER 502型）于耳鼻喉科听力检查室进行纯音测听，逐一测听1000、2000、4000、8000、1000、500、250 Hz共6个频率的纯音气导听阈。参照声学听阈与年龄关系的统计分布(GB/T 7582-2004/ISO 7029：2000)国家标准将频率特异性听阈转换为Z值（Z值为在给定频率上个体实际听阈与中位听阈的差异），将每个研究对象按照Z值进行排序，选取最好的听力样本作为对照组（即非易感组），最差的听力样本作为病例组（即易感组）。样本的选取依据Z值得大小进行。按照Z值的大小进行排序，Z值排列处于最顶端与最底端的分别汇入对照组与病例组。Z值的计算公式如下：

其中Hmd，Y指听阈中值；md，Y代表年龄的中位数；Y代表指定年龄；α指男性和女性的系数，可以在GB/T 7582-2004/ISO 7029：2000（声学 听阈与年龄关系的统计学分布）中查找。参照GB/T 7582-2004/ISO 7029：2000，得知中值以上的分布为近似标准偏差是Su的高斯分布，中值以下的分布近似标准偏差是Sl的高斯分布。上述参数bu和bl的值可在GB/T 7582-2004/ISO 7029：2000表2中查找。按照上述计算公式，当Z值大于0时为易感者，Z值小于0时为非易感者。因老年性耳聋患者主要是出现高频听力的下降，所以在计算中多采用Z248（即分别算出2 kHz、4 kHz和8 kHz对应的Z值，再计算其平均数即为Z248）[5，6]。

1.2.2 研究对象 共选出易感者52例，非易感者26例，共78例样本，随机选取50例组成建模组（易感者30例，非易感者20例）、28例组成模型验证组（易感者22例，非易感者6例）。其中实验组男性19例，女性33例，平均年龄71.5±7.85；对照组男性20例，女性6例，平均年龄70.69±7.23。52例患者按听力损失程度按照世界卫生组织（WHO1997）听力障碍分级标准可分为轻度31例，中度20例，重度1例。易感组52例中患2型糖尿病3人、高血压病3人、同时患2型糖尿病和高血压病1人；非易感组26例中患2型糖尿病2人、高血压病1人，口服二甲双胍5人、口服硝苯地平缓释片6人、阿司匹林肠溶片10人（抽血前1周停药）。易感组与非易感组年龄、性别、合并全身疾病情况相比，均无显著性差异（P＜0.05）。所有的受试对象签署知情同意书，实验方案经我院医学伦理委员会批准。

1.2.3 血清的采集及处理 采集受试对象空腹外周静脉血约4 ml，用临床离心机以3000 r／m离心7 min，立即冻存血清样品于-80 ℃冰箱中。自4℃冰箱取出磁珠试剂盒，取200 μl 八连排样品管置于孔板上，依次加入10 μl磁珠，加入95 μl磁珠结合缓冲液，加入10 μl血清样本，在室温静置5 min，将样品管在磁珠分离器上静置1 min，磁珠富集到管底并贴壁，与悬浮的液体分离，液体应该变为澄清，吸去上清的液体。将样品放入孔板中，加入100 μl磁珠清洗液缓冲液，静置2 min。然后将样品管在磁珠分离器上静置1 min，吸去上清液体。将样品放置于孔板上，加入10 μl磁珠洗脱液反复吸打十次以上，放置5 min，使磁珠和洗脱液混悬均匀。将样品放于磁珠分离器上，静置1 min，使磁珠与悬浮液充分分离，将上清液移出到已标记的0.2 ml样品管，然后进行质谱分析。

1.2.4 差异蛋白的鉴定 质谱仪按照以下参数检测肽段信号：正离子模式，以及扫描范围400～1500Da，二级扫描范围依赖于一级母离子质核比自动选择，离子源电压2900 V。获得质谱图后输入proteome discoverer 1.4（PD，thermo）软件，软件先对质谱谱图进行筛选，然后用mascot进行搜索，搜索结束后，PD软件根据mascot搜索结果和第一步筛选后的谱图进行定量分析。定量参数设置如下：肽段取值方法和标准化方法均为中位数，差异倍数大于1.2倍、P＜0.05为具有显著性差异。

2 结果

2.1 出峰差异显著性统计

建模组50个血清多肽样品，共分析出104个峰，其中有任一样品中峰强度高于300 Da的多肽峰个数为40个。利用软件对病例与对照组的血清蛋白指纹图谱进行分析对比后得到出峰差异性有统计学意义的有9个（P＜0.05），分子量分别为4047.1 Da、2957.1 Da、4084.5 Da、4260.1 Da、2102.9 Da、1288 Da、3276 Da、4146.2 Da、3153.4 Da，其中6个表达上调，3个表达下调（见表1）。

2.2 差异蛋白的鉴定

9个差异多肽峰中，通过搜库鉴定出8个，未鉴定出4047.1多肽峰。去除血清高峰度蛋白IgG，7个多肽分别代表5种蛋白，分别为载脂蛋白J、胰蛋白酶抑制剂、血小板生成素、补体C4b和角蛋白（hornerin）。具体多肽序列及相关信息见表1。

3 讨论

据统计，50%以上的超过80岁的老年人有25 dB或以上的听力损失，听力下降正在严重影响老年人的生理和心理健康[7]，降低其生活质量，研究老年性耳聋的发生机制和有效的防治措施已经刻不容缓。在研究老年性耳聋过程中人们发现，尽管随着年龄的增加听觉敏感度逐渐下降，但是听阈的变化在人群中还是具有很大的差异，40%～50%的老年性耳聋与遗传有关[8]，于是寻找老年性耳聋易感基因就成了研究者探索老年性耳聋发病机制的热点。

近年，基因水平研究老年性耳聋发病机制的进展缓慢。目前研究者主要使用候选基因关联分析和全基因关联分析进行老年性耳聋易感基因的筛选，其中候选基因关联分析是研究中常用的方法，通过此方法发现的易感基因包括NAT2，GSTT1，GATM1，GTHL2，GRM7，CDH23等[9]。由于老年性耳聋发病机制复杂，牵涉多个基因、基因与基因的相互作用以及基因与环境的相互作用等方面，许多已经发表的研究所得结论差异性较大，因此Fransen等[10]提出老年性耳聋可能从本质上是高度多基因化的，可能并不存在某个主要基因起作用的可能。

蛋白质是细胞功能的执行者，蛋白质组学的进步提供了筛选差异蛋白的方法，为探讨老年性耳聋易感性、筛选易感个体带来新的希望。已有研究选用弱阳离子磁珠结合MALDI-TOF MS技术筛选老年性耳聋易感者与非易感者血清差异蛋白表达情况，发现差异有统计学意义的多肽峰有9个（P＜0.05），其中6个在易感组中上调，3个下调，并利用编号为55和49的两个多肽建立了老年性耳聋易感个体诊断模型[6]。本研究在上述基础上进一步对差异表达的蛋白进行了鉴定，结果提示载脂蛋白J、胰蛋白酶抑制剂、血小板生成素、补体C4b和角蛋白（hornerin）在老年性耳聋易感个体血清中存在差异性表达，有可能成为老年性耳聋易感个体血清特异性标记物。

载脂蛋白J（apolipoprotein j，ApoJ）又称clusterin，是由CLU基因编码的糖基化α-β异源二聚体细胞外伴侣蛋白，主要存在于人高密度脂蛋白和极高密度脂蛋白中，在多种组织中都有表达，其中在脑组织中含量最高，主要由星形胶质细胞产生。ApoJ的生理功能错综复杂，主要是通过伴侣作用清除细胞碎片和错误折叠蛋白执行细胞保护功能，还可以作为细胞信使作用调节促凋亡通路，从而促进脂质代谢、调节动脉粥样硬化、调节补体系统、抗细胞凋亡和促进细胞间相互作用[11]。动物实验研究结果提示CLU在内耳的发育和正常听觉功能维持中可能起重要作用[12，13]，ApoJ可能参与了阿尔兹海默病等神经退行性疾病病理过程[11]，而病例对照研究显示听力减退是阿尔兹海默病的危险因素[14]，提示两种疾病具有一定的相关性。我们的研究结果显示在老年性耳聋易感个体血清中，ApoJ表达上调，提示该蛋白也可能参与了老年性耳聋这种神经退行性病变的发生和发展过程，易感个体可能希望通过上调ApoJ来保护听觉相关的神经元、清除细胞内垃圾，因此可能对听功能具有保护作用。

表1 差异表达蛋白数据

血小板反应素（thrombospondin，TSP）是一类三聚体调节性糖蛋白，也是一种内源性血管生成抑制因子，参与了细胞与细胞之间、细胞与基质之间的信息交流，在细胞表面调节细胞因子，并在组织和细胞的生长和分化中起重要作用。TSP-1是TSP家族中重要的一员，具有促进粒细胞趋化反应、促进血小板激活和聚集、促进内皮细胞凋亡、抑制内皮细胞增殖等作用[15]，与肿瘤[15]、糖尿病[16]、肾脏疾病[17]等的发生和发展关系密切，目前还未见到与耳聋相关的报道，本研究发现在老年性耳聋易感者血清中TSP表达下调，提示血管因素与老年性耳聋的发生可能存在密切相关性，积极改善血管状态有助于减缓老年性耳聋进展。

研究发现丝氨酸和金属蛋白酶家族在中耳炎的发生中起重要作用，其蛋白酶抑制剂可以抑制中耳炎症反应进程，为了评价其安全性，有研究将α1抗胰蛋白酶制剂直接注射入南美洲栗鼠听泡，结果发现该药物对内耳未造成明显毒性作用，提示α1抗胰蛋白酶制剂治疗中耳慢性炎症具有潜在的价值和较高的安全性[18]。角蛋白和补体C4b均未见到与耳聋相关的报道。

上述5种蛋白在老年性耳聋易感者血清中出现差异性表达，提示这些分子有可能成为老年性耳聋易感个体特异性血清标志物，其在老年性耳聋发病机制中所起的作用还需要进一步研究。

老年性耳聋主要由听觉器官老化所致，这一过程快慢不一，是生物的恒定规律，老年性耳聋发生与多种原因有关，但存在个体差异性[19]。是否合并全身疾病是影响老年性耳聋发生的重要因素之一，普遍认为患有糖尿病、高血压等疾病的老年人身体机能减退发生率显著高于无上述疾病的老年人[19]，为了排除干扰因素、更好地研究遗传易感性在老年性发生机制中的作用，我们的研究在选取研究对象时进行了严格的筛选，将患有多种老年疾病的患者排除在外，并在抽血采样前停用阿司匹林肠溶片1周，使易感组和非易感组具有更强的可比性，结果也更有利于反映个体遗传易感性。因此本次研究鉴定的5个老年性耳聋易感个体血清差异有可能成为老年性耳聋易感个体筛选的血清特性分子生物标记物，本文为进一步研究老年性耳聋发病机制提供了实验数据，上述结果还需要进行进一步的验证。

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