王建尧，王 斌△，吴宙光，叶晓烁，陈子民，冯 奇，刘 冬，姚 君

(1.广东省深圳市儿童医院普外二科 518000；2.广东省深圳市人民医院消化内科 518000)

胆道闭锁是婴儿期累及肝内外胆管、最终导致终末期肝硬化的严重肝脏疾病[1-4]。miRNA-129-5p是新近发现的一个与纤维化疾病紧密相关的小分子RNA(miRNA)家族，在多种器官纤维化的调控中发挥着重要作用[5-8]。在胆道闭锁胆管上皮细胞纤维化过程中，上皮间质转化(epithelium-mesenchymal transition，EMT)机制发挥着至关重要的作用[9]。本研究将构建TGF-β1诱导的小鼠胆管EMT分化细胞模型，检测TGF-β1刺激后胆道上皮细胞株EMT相关标志物及细胞外基质(ECM)表达水平，并检测miRNA-129-5p的表达变化，探讨miRNA-129-5p调控EMT的机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物与试剂 动物BALB/c小鼠[广东省医学动物实验中心，SCXK(粤)2014-0035]，5周龄；Trizol(美国Invitrogen公司)；DNA荧光染料SYBR Green Ⅰ(美国Invitrogen公司)；引物(美国Invitrogen公司)；RNA酶抑制剂(美国Invitrogen公司)；Taq酶(美国Invitrogen公司)；10×buffer(美国Invitrogen公司)；5×buffer(美国Invitrogen公司)；LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；Pre-miRTMmiRNA-129-5p(美国Invitrogen公司)；Pre-miRTMmicroRNA Precursor阴性对照(美国Invitrogen公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物有限公司)；重组人TGF-β1(美国Santa cruz Biotechnology公司)；小鼠抗人β-actin单克隆抗体(美国Santa cruz Biotechnology公司)；兔抗人钙黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗体(美国Santa cruz Biotechnology公司)；山羊抗人claudin1多克隆抗体(美国Santa cruz Biotechnology公司)；小鼠抗人波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体(美国Santa cruz Biotechnology公司)；兔抗人FN多克隆抗体(美国Santa cruz Biotechnology公司)；辣根过氧化物酶标记抗山羊二抗(美国Santa cruz Biotechnology公司)；辣根过氧化物酶标记抗山羊二抗(美国Santa cruz Biotechnology公司)；miRNA提取试剂盒(美国Applied Biosystems公司)；miRNA反转录试剂盒(美国Applied Biosystems公司)；实时荧光定量PCR (RT-PCR)试剂盒(美国Invitrogen公司)。

1.2方法

1.2.1胆道闭锁动物模型构建及肝脏苏木精-伊红……