徐海军，高温婷，杨 健，张亚妮，谷仿丽，何晓梅，乔德亮

(1.皖西学院 生物与制药工程学院健康养殖与动物疫病监测预警工程技术中心，安徽 六安 237012；2.安徽省植物细胞工程技术中心，安徽 六安 237012)

我国已进入老龄化社会。提高老年人的身体健康水平，减少相关老年疾病的发生，对于降低社会的医疗负担，提高老年人的生活质量均非常重要。肠道是动物消化吸收食物中营养素的主要场所，也是动物机体接触环境病原微生物及有毒物质的主要部位。中医学自古就有“肠道乃百病之源”的说法。可见保持肠道健康非常重要。霍山石斛是六安市霍山县著名的道地药材，为历史悠久的名贵中草药，是古代“九大仙草”之一。《本草纲目》记载：霍山石斛具有强阴益精，厚肠胃，平胃气，长肌肉，益智除惊，轻身延年之功效。研究发现霍山石斛的主要有效成分为石斛多糖[1-2]。石斛多糖具有降血脂[3-4]、抗氧化[5-7]、增强免疫力[8]等作用。目前关于霍山石斛或其他石斛多糖的抗衰老作用已有少量研究[9-13]，但对衰老动物肠道健康影响的研究几乎未见报道。本项目研究了霍山石斛多糖对衰老模型大鼠肠道形态结构、肠道消化酶活力和粪中营养素含量的影响，为将霍山石斛开发成抗衰老保健品提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，购自安徽医科大学动物实验中心，生产许可证号：scxk(皖)2011-002。

1.2 药品与试剂

霍山石斛枫斗由安徽省霍山石斛产业开发协同创新中心提供(经皖西学院生物与制药工程学院陈乃富教授鉴定为正品)，参照陈乃东[14]的方法提取霍山石斛精制多糖，用蒽酮-硫酸比色法测得霍山石斛枫斗多糖含量为29.4%；蛋白浓度测定试剂盒、蛋白酶活性测定试剂盒、淀粉酶活性测定试剂盒和脂肪酶活性测定试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司；D-半乳糖为Sigma公司产品；氯仿、丙酮、无水乙醇、正丁醇等为国产分析纯试剂。

1.3 主要仪器

TU-1901 紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；HK-02 A型手提式粉碎机(广州市旭朗机械设备有限公司)；FA1204 B型电子分析天平(上海越平科学仪器有限公司)；冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；RE-52 AA 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；DD5台式大容量低速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)。

1.4 实验分组及给药

SD大鼠养至4月龄时开始正式试验。将30只大鼠随机分为对照组、衰老模型组和衰老模型+霍山石斛多糖组，每组10只。衰老模型大鼠的制作参照文献[15]方法，每天在颈部皮下注射D-半乳糖125 mg·kg-1·BW-1。对照组大鼠每天颈部皮下注射等量生理盐水。衰老模型+石斛多糖组大鼠每天灌胃霍山石斛多糖溶液，剂量为200 mg·kg-1·BW-1。对照组和衰老模型组大鼠每天灌胃等剂量生理盐水。每隔7天对大鼠进行一次称重，根据其体重变化调整D-半乳糖的注射量和霍山石斛多糖的灌胃量。

1.5 指标测定

8周后将大鼠颈动脉放血处死，剪开腹腔，以盲肠为基准，采集距盲肠基部4cm前的一段回肠食糜，用蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性测定试剂盒分别测定三种酶的活性；采取距盲肠基部6cm前的一段回肠，用中性福尔马林溶液固定，然后制作石蜡切片，测定小肠绒毛高度和隐窝深度(每只大鼠的回肠作3张不连续的切片，每张切片上测定3根伸直且形态完整的小肠绒毛高度和隐窝深度)；取直肠内粪便，用凯氏定氮法测定粪中粗蛋白含量，用索氏提取法测定粪中粗脂肪含量。

1.6 数据统计与分析

采用DPS软件对所测数据进行单因素方差分析，并用Ducan’s进行多重比较。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

各组大鼠回肠组织形态组织结构、消化酶活性和粪便中营养素含量的测定结果见表1。从表1可见，与对照组相比，衰老模型组和衰老模型+霍山石斛多糖组的小肠绒毛高度显著变短(p<0.01)，小肠隐窝深度显著增加(p<0.01)，小肠绒毛高度：小肠隐窝深度显著变小(p<0.01)；与衰老模型组相比，衰老模型+霍山石斛多糖组的小肠绒毛高度显著升高(p<0.01)、小肠隐窝深度显著降低(p<0.01)，小肠绒毛高度：小肠隐窝深度显著增加(p<0.01)，表明D-半乳糖诱导的致衰作用对小肠形态结构有不利影响，这种作用可被霍山石斛多糖部分逆转，但仍不能恢复到正常水平。在小肠消化酶活性上，衰老模型组的蛋白酶活性显著低于对照组和衰老模型+霍山石斛多糖组(p<0.01)，但衰老模型+霍山石斛多糖组的蛋白酶活性与对照组相比，没有显著差异(p>0.05)；衰老模型组的淀粉酶活性显著低于对照组和衰老模型+霍山石斛多糖组(p<0.01)，但衰老模型+石斛多糖组的蛋白酶活性与对照组相比没有显著差异(p>0.05)；各组的脂肪酶活性没有显著差异(p>0.05)，说明D-半乳糖诱导的衰老作用对蛋白酶和淀粉酶活性影响较大，且这种作用基本上可被饲喂石斛多糖阻断。在粪中粗蛋白含量和粗脂肪含量上，衰老模型组和衰老模型组+霍山石斛多糖组的粪中粗蛋白含量显著高于对照组(p<0.01)，衰老模型组粪中粗蛋白含量显著高于衰老模型+霍山石斛多糖组(p<0.05)；各组大鼠粪中粗脂肪含量没有显著差异(p>0.05)，说明D-半乳糖诱导的衰老增加了粪中蛋白质的排出，饲喂石斛多糖对减少衰老模型大鼠粪中蛋白质的排出有一定作用。

表1 大鼠回肠组织形态组织结构、消化酶活性和粪便中营养素含量的测定结果(n=10)

注：同一行数据标有不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，标有不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

3 讨论

衰老又称老化，通常是指在正常状况下生物发育成熟后，随年龄增加，自身机能减退，内环境稳定能力与应激能力下降，结构、组分逐步退行性变，趋向死亡，不可逆转的现象[15](P394-396)。生物衰老无法阻止，但可以延缓。D-半乳糖致衰老模型造模时间短、操作简便、模型易于建成、重复性好，表现出与自然衰老动物相似的衰老体征，已成为国内较公认的衰老动物模型[16]。增龄可降低小肠绒毛高度，且伴有小肠隐窝数量的减少，从而导致消化吸收功能减退[17-18]。连续皮下注射D-半乳糖0.125g·kg-1·d-142d复制的衰老模型大鼠小肠粘膜厚度及绒毛高度降低，该变化与26月龄自然衰老大鼠肠道老化程度相当[19]。因此，本研究用D-半乳糖致衰大鼠模型来观察霍山石斛多糖对衰老动物肠道消化吸收功能和形态结构的影响，在动物模型的选取上是合适的。

本研究发现给大鼠连续灌胃200mg·kg-1·BW-1霍山石斛多糖溶液，可以显著缓解D-半乳糖引起的衰老模型大鼠小肠绒毛高度的降低和隐窝的变深，但不能完全恢复到对照组的水平。D-半乳糖也使衰老模型大鼠小肠蛋白酶和淀粉酶活性显著降低，但霍山石斛多糖可以基本消除这种影响。D-半乳糖对衰老模型小肠脂肪酶活性影响不明显。衰老模型大鼠粪中粗蛋白含量显著高于对照组，说明衰老模型动物对饲料中的蛋白质消化吸收减弱，导致排除的粗蛋白较多。另一种可能是衰老模型大鼠的肠道处于一种低度的炎症反应，有较多的肠上皮细胞死亡脱落，其分解产物随粪便一起排出，从而引起粪中粗蛋白水平升高。本研究中衰老动物粪便中粗蛋白水平甚至高于饲料中粗蛋白水平，可以支持这种猜测。三组大鼠粪中粗脂肪含量没有显著差异。霍山石斛多糖对小肠脂肪酶活性和粪中粗脂肪含量没有显著影响，说明霍山石斛多糖对衰老模型大鼠的脂肪消化吸收影响不明显。霍山石斛多糖为何对粗蛋白和粗脂肪的消化吸收产生不同影响，其原因有待进一步探讨。

D-半乳糖衰老模型是在一定时间内连续不断的注射D-半乳糖，以增高大鼠细胞内半乳糖浓度，并在醛糖还原酶催化作用下，将半乳糖还原成半乳糖醇，后者不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响细胞的正常渗透压，并伴随有大量自由基产生，导致细胞出现功能障碍、代谢紊乱的症状，短时间内引起机体衰老[20]。霍山石斛多糖具有较好的抗氧化作用[4-6]。因此，霍山石斛多糖对D-半乳糖导致的氧化应激的缓解作用可能是霍山石斛多糖的抗衰老机制之一。

4 结论

给大鼠连续灌胃200 mg·kg-1·BW-1霍山石斛多糖溶液，可以改善衰老模型大鼠小肠形态结构，并对消化酶活性和营养素吸收产生有益影响。该结果为古人关于霍山石斛“厚肠胃……轻身延年”的药理效应认识提供了实验依据。

参考文献：

[1]郁美娟，孟庆华，黄德音，等.石斛属植物有效成分及药理研究[J].中成药，2003，25(11)：918-921.

[2]凌志扬，房玉良.石斛的化学成分及药理作用[J].中国当代医药，2012，19(5)：13-16.

[3]张静，连超群，吴守伟，等.霍山石斛胶囊降血脂疗效的实验研究[J].中国老年学杂志，2010，30(21)：3134-3136.

[4]张静，连超群，林毅，等.霍山石斛胶囊对高脂血症大鼠血脂和脂质过氧化水平的影响[J].激光生物学报，2010，19(5)：628-633.

[5]Xu H, Liu J, Wang ZT, et al．The Scavenging of Reactive Oxygen Species by Crude Drugs and Cultured Tissues of Five Species of Dendrobium Sw[J]. J Plant Res Environ, 200l(10): 35-37．

[6]陈凤芹，黄德武，何苗，等.霍山石斛胶囊抗过氧化作用的研究[J].动物医学进展，2007，28(10)：54-58.

[7]李秀芳，邓媛元，潘利华，等.霍山石斛多糖对糖尿病性白内障大鼠眼球晶状体组织抗氧化作用的研究[J].中成药，2012，34(3)：418-421.

[8]Luo H L, Cai T Y, Chen Q L, et al. Enhancement of Dendrobium Candidum Polysaccharide on Killing Effect of LAK Cells of Umbilical Cord Blood and Peripharal Blood of Cancer Patients in Vitro[J]．Chin J Cancer, 2000(19): 1124-1126．

[9]王令仪.石斛多糖和生物碱测定及多糖抗衰老实验研究[D].遵义：遵义医学院(硕士学位论文)，2009.

[10]李莉娜.铁皮石斛多糖改善D-半乳糖诱导小鼠衰老作用研究[D].苏州：苏州大学(硕士学位论文)，2012.

[11]梁颖敏.铁皮石解对雌性衰老小鼠的抗衰老作用及其机理研究[D].广州：广州中医药大学(硕士学位论文)，2011.

[12]张静，连超群，胡明洁，等.霍山石斛胶囊延缓果蝇衰老的观察[J].蚌埠医学院学报，2010，35(12)：1204-1206.

[13]何苗.“霍山石斛胶囊”抗衰老及对DM大鼠降血糖作用的研究[D].合肥：安徽农业大学(硕士学位论文)，2007.

[14]陈乃东，陈乃富，王陶陶，等.组培霍山石斛、野生霍山石斛及河南石斛多糖及乙醇溶出物动态积累规律研究[J].天然产物研究与发，2015，27(12)：2090-2094.

[15]邹承鲁.当代生物学[M].北京：中国致公出版社，2000.

[16]雷鸣，朱祖健.D-半乳糖致衰老的研究进展[J].解剖科学进展，2011，17(1)：83-85.

[17]吴本俨，陈思文.胃肠道老化的现代认识[J].中国临床医生杂志，2015，43(3)：1-2.

[18]Chen JS,Zhang XL. Changes of Microvascular Architecture, Ultra-structure and Permeability of Rat Jejunal Villi at Different Ages[J].World J Gastroenterol, 2003,9(4):795-799.

[19]任卫英，李锂，吴克芬，等.自然衰老与D-半乳糖诱导的衰老大鼠肠道形态学和上皮紧密连接蛋白表达的对比研究[J].老年医学与保健，2016，22(4)：215-218，222.

[20]陈玻，周玫，刘尚喜，等.营养、衰老与自由基理论[J].营养学报，2005，27(3)：177-180.