蔡向杰，屈云萍，王亚涛，李 哲，姜国志

1神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051400；2中药注射剂新药技术开发国家地方联合工程实验室

枳椇为鼠李科(Rhamnaceae)拐枣属(Hovenia Thunb.)落叶乔木，始载于《唐本草》，又名拐枣、金钩子、甜半夜等。枳椇子系枳椇植物干燥成熟的种子，有清热利尿，解酒毒之功效，主治烦热、口渴、呕吐、二便不利等症。枳椇子应用历史悠久，是国家卫生部批准的药食同源植物之一，其主要化学成分包括:皂苷、糖苷、生物碱、黄酮类化合物、脂肪酸及其他微量成分［1-4］。许多学者研究认为枳椇子的疗效与其所含成分的抗氧化作用密切相关，其中以黄酮类和皂苷类物质尤为重要。枳椇子作为药食同源的中药之一，具有良好的发展前景，其有效成分的提取和纯化对枳椇子的质量控制意义重大。响应面分析法(response surface methodology，RSM)是利用合理的设计并通过试验得到一定数据，采用多元二次逐步回归方差拟合因素与响应值之间的函数关系，通过回归方程分析寻找最佳工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法［5-10］，已经广泛应用于中药材提取工艺研究中［11-13］。实验以指标成分(皂苷含量、总黄酮含量及干膏收率)的综合得分为指标，采用响应曲面法建立多元二次回归方程，用以优化枳椇子的提取工艺，为其开发和应用及质量控制提供数据来源，为其产业化提取数据支持。

1 材料与方法

1.1 试药 枳椇子药材购于安国市振宇中药材饮片有限公司，产地湖南，批号：150608。经河北省药品检验研究院孙宝惠老师检验鉴定为鼠李科(Rhamnaceae)拐枣属(Hovenia Thunb.)枳椇药材的种子。芦丁对照品(纯度92.5%)购自中国药品生物制品检定所，规格100 mg/支，批号：100080-200707。乙醇、乙醚、正丁醇等其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器 METTLER-ALC-210.4电子分析天平(上海梅特勒托利多仪器有限公司)；HC-400Y2粉碎机；紫外可见分光光度计；HH-SB型电热恒温水浴锅(科伟仪器)；SHB-Ⅲ循环水式真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 样品处理 将枳椇子用粉碎机粉碎至40～60目，混匀密封备用。

1.3.2 皂苷含量和总黄酮含量的提取 精密称定一定量的枳椇子粉末，加入一定溶剂配成料液，在一定温度下提取一定的时间，提取液过滤浓缩成干膏粉。

1.3.3 总黄酮的含量测定［14］精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品50 mg，置于100 mL量瓶中，用80%乙醇溶解并定容。精密量取上述对照品溶 液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 分 别 置 入25 mL量瓶中，加5%NaNO2溶液1.0 mL，摇匀，放置6分钟，加10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，摇匀；放置6分钟，加入4%NaOH溶液10.0 mL，用80%乙醇稀释至刻度，混匀。放置15分钟在500 nm波长处，以相应试剂作空白，分别测吸收度。以吸收度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.4皂苷的含量测定［15］取枳椇子干膏粉约0.5 g，精密称定，用水20 mL分次溶解并洗入分液漏斗中。用乙醚分次振摇脱脂，每次20 mL，至乙醚层无色，弃去乙醚洗液。用水饱和正丁醇分次振摇提取，每次20 mL，至正丁醇层无色，合并正丁醇提取液于已知重量蒸发皿中，置水浴上蒸干，105℃干燥至恒重，称重，计算。

1.4 单因素实验

1.4.1 提取时间对结果的影响 称取枳椇子粉末1.0 g，以纯化水作为溶剂提取1次，分别提取1、2、3、4、5、6 h，按照“1.3.3 项”及“1.3.4 项”的方法进行测定。

1.4.2 提取次数对结果的影响 称取枳椇子粉末 1.0 g，以纯化水作为溶剂，分别提取 1、2、3、4、5、6次，每次提取 1 h，按照“1.3.3项”及“1.3.4项”的方法进行测定。

1.4.3 溶剂倍量对结果的影响 称取枳椇子粉末 1.0 g，分别加入 5、6、7、8、9、10 倍量纯化水提取1次，提取2小时，按照“1.3.3项”及“1.3.4项”的方法进行测定。

1.5 响应面分析因素水平的选取和设计 通过单因素实验结果筛选出显著性影响因素后，以显著性影响因素(提取时间、提取次数、溶剂倍量)作为考察因子，优化枳椇子的提取工艺。响应曲面因素水平编码见表1。

表1 响应曲面实验因素水平编码

2 结果与分析

2.1 综合评价指标和权重的选择 以提取时间、提取次数、溶剂倍量为因素，每个因素选3个水平，以干膏收率与干膏中总黄酮含量、皂苷含量为指标，根据指标间的重要性差异给出各指标的权重，确定综合评分=干膏收率×30+干膏中总黄酮含量×40+ 干膏中皂苷含量×30［16］。

2.2 提取溶剂的选择［17-18］目前文献中报道，枳椇子提取方式有水提和70%醇提。所以本实验分别加入5倍的纯化水和70%乙醇，提取2次，每次2小时，旨在对枳椇子提取方式进行考察分析。结果表明，水提皂苷含量为4.15%，总黄酮含量为4.26%，收率为6.86%。而醇提皂苷含量为3.57%，总黄酮含量为3.88%，收率为4.97%。按2.1进行综合评分后结果为：水提综合评分为5.007，而醇提综合评分为4.114。可见水提优于醇提，所以提取溶剂最终确定为纯化水。

2.3 绘制总黄酮标准曲线 按照1.3.3绘制总黄酮标准曲线，线性回归方程为A=0.038 65C-0.00119，R=0.9999，线性范围 5.11～25.55mg/L。2.4 单因素实验

2.4.1 提取时间对结果的影响 称取枳椇子粉末1.0 g，以纯化水作为溶剂提取1次，分别提取1、2、3、4、5、6 次，按照“1.3.3 项”及“1.3.4 项”的方法进行测定，并根据2.1中方法对结果进行综合评分。提取时间为1～3小时随着提取时间的延长，得分逐渐增加，当提取时间达到3 h时得分最高。继续提取，综合得分反而下降，并在提取5 h时趋于平稳。原因是随着提取时间的延长，产生了大量杂质，使得收率虽有所增加，但2个含量均大大下降使得分下降。因此，综合考虑将提取时间定为3小时最合适。见图1。

2.4.2 提取次数对结果的影响 称取枳椇子粉末 1.0 g，以纯化水作为溶剂，分别提取 1、2、3、4、5、6次，每次提取 1 小时，按照“1.3.3项”及“1.3.4项”的方法进行测定，并通过“2.1项”对结果进行综合评分。提取次数为1～3次时随着提取次数的增加，得分逐渐增加。增加提取次数得分反而下降，并趋于平稳。原因是提取4次时已经将有效成分完全提取，再增加提取次数导致提取出杂质，影响了综合得分，所以将提取次数定为3次最为合适。见图2。

2.4.3 溶剂倍量对结果的影响 称取枳椇子粉末 1.0 g，分别加入 5、6、7、8、9、10 倍量纯化水提取 1次，提取 2小时，按照“1.3.3项”及“1.3.4项”的方法进行测定，并通过“2.1项”对结果进行综合评分。溶剂倍数5～8倍时得分逐渐增加，当溶剂量为8倍时得分最高，这是因为提取溶剂的增加使药材充分的浸提，有利于有效成分的浸出，但当溶剂达8倍量时，含量几乎达到饱和。再继续加大溶剂量，虽收率有所增高，但因浸出了杂质导致最终评分下降。因此，综合考虑将溶剂量定为8倍量较为合适。见图3。

图1 提取时间的影响

2.5 回归模型的建立和分析 利用Design-Expert 8.0.6对下表数据进行多项式回归分析，建立枳椇子提取工艺参数的回归模型，得到总黄酮含量、皂苷含量及收率综合得分编码自变量A、B、C的二次多项回归方程：方程Y=0.014 A+0.56B+0.46C-0.30AB+0.007 5AC-0.49BC+0.038 A2-0.37B2-0.29C2+8.28。对于该模型进行方差分析和模型系数显著性检验，结果见表2。

图2 提取次数的影响

图3 溶剂倍量的影响

表2 Box-Behnken实验设计及结果

对该模型进行方差分析及模型系数显著性检验，可见回归模型极其显著(P＜0.01)，说明建立的模型有意义；失拟项P＞0.05，表明差异无统计学意义，模型拟合度良好，随机产生的模型的残差可以不计，可用此模型和方程来分析预测枳椇子总黄酮含量、皂苷含量及收率的综合得分。结果见表3。

模型由方差分析结果可知，对回归方程进行检验，模型的矫正系数R2Adj为0.981 9，说明此模型能解释98.19%响应值的变化，即此数据拟合度很高，试验误差小，因此可以用于枳椇子提取工艺的分析和预测。回归模型系数显著性检验结果中可以看出，模型的一次项中B、C影响显著，二次项B2影响显著，其他各项对综合得分的影响不是简单的线性关系［19］。

2.6 响应曲面分析与优化 响应曲面图是根据回归方程绘制的，是响应值在各实验因素交互作用下得到的结果构成的一个三维空间曲面，可以预测和检验变量的响应值以及确定变量的相互关系。AB、AC和BC之间均存在交互作用，根据回归方程做出模型的响应曲面及等高线见图4。

表3 回归模型和方差分析

图4 等高线和响应面图

利用Design-Expert 8.0.6软件求解回归方程。最高综合得分为8.787 55，其最优提取条件为提取时间为2.00 h，提取次数为4.00次，溶剂倍量为7.86倍，此条件下得到皂苷含量为8.910 1%，总黄酮含量为6.420 7%，干膏收率为11.820 8%，综合得分8.787 56。

2.7 最佳提取工艺确定及验证实验 为了方便，将提取时间定为2小时、提取次数4次、溶剂倍量定为8倍量，依据所确定的最佳提取工艺进行实际验证(n=3)，实际测的枳椇子皂苷平均含量8.879 7%(RSD=1.4%)，总黄酮平均含量为6.452 1%(RSD=0.8%)，干膏收率为11.117 9%(RSD=0.5%)，综合评分为8.580 12，这与理论预测值(8.787 56)接近；因此，采用Box-Behnken实验设计优化的得到得枳椇子提取工艺条件准确可靠，具有实用价值。

3 结论

本实验利用响应曲面法，通过二次回归设计得到枳椇子皂苷含量、总黄酮含量和干膏收率与提取时间、提取次数和溶剂倍量关系的回归模型。最终得出最优提取工艺条件为提取时间2小时、提取次数4次、提取溶剂8倍量，此条件下得到皂苷含量为8.910 1%，总黄酮含量为6.420 7%，干膏收率为11.820 8%。中药具有多组分、多靶点的特点，通过将多指标综合评分能够筛选以多个目标成分在同一提取条件下的提取工艺并进行综合评价，兼顾各指标的协同效应，减少了单因素分别试验的局限性，比单一指标筛选更为科学、全面，能够提高提取效率，减少服用剂量、提高疗效要求，更可以保证制剂的质量［20］。

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