马 妍 ，郭利平 ，樊官伟 ，任 明 ，张 磊 ，王 怡 ，李 岩 ，孙 晓 ，赵宏杰 ，刘 丹

1天津中医药大学附属保康医院，天津 300193；2天津中医药大学；3天津中医药大学第一附属医院；4天津市武清区中医医院

缺血预适应(ischemic preconditioning，IPC)是减轻缺血再灌注损伤的重要措施，缺血预适应的保护效应分为预适应即刻产生且持续2～3小时的早期保护(early protection，EP)和在预适应后12～24小时出现且持续24～72小时的延迟保护(delayed protection，DP)。研究表明，DP对心脏的保护作用包括改善心肌坏死、抗心律失常、保护血管内皮、抗心肌顿抑、保护心肌舒张功能等［1］。相对于EP，DP效应具有较长的保护作用而更具有应用价值。缺血预适应是一种机械性操作，无法避免血管壁损伤、斑块脱落等风险，因此根据IPC的机制，以药物激发或模拟机体内源性保护物质以减轻心肌损伤更具有临床应用价值。相对于西药在某一环节发挥作用，中药可以通过多种途径作用于损伤部位，其有效性更有保障。中药的DP效应已被研究证实［2］，但对其机制研究尚不充分。DP效应的产生涉及细胞内信号途径的激活，目前研究认为包括“触发物质-中介物质-效应子”三个环节［3］。热休克蛋白70是机体内重要的应激蛋白，在热休克家族蛋白中表达量最高［4］，热休克蛋白70是分子量在70KD左右的热休克蛋白，是缺血预适应DP效应机制中重要的效应子，其对心肌的保护作用可能通过抗凋亡、抗氧化应激、分子伴侣、保护内皮功能、稳定细胞骨架等方面实现［5］。本实验以缺氧复氧模拟缺血再灌注过程，研究芪参益气滴丸预适应对心肌细胞的延迟保护作用，以及其机制是否与上调心肌细胞内源性HSP70相关。

1 材料与方法

1.1 试剂 芪参益气滴丸溶液由天津天士力集团提供中药浸膏，按一定比例于完全培养基中混合溶解而成。细胞增殖/毒性检测(CCK-8)试剂盒(同仁化学研究所，日本，Lot.FH783)，乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(北京中生生物工程高技术公司，Lot.142715003)，丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，Lot.20140117)，超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(南京建成生物工程研究所，Lot.20140115)，大鼠 70kDa热休克蛋白 1A(HSPA1A)检测试剂盒(Cloud-Clone公司，美国，Lot.D600)，NAC(Sigma 公司，美国，Lot.YT305)，UNIQ-10 column Trizol总RNA抽提试剂盒(生工生物技术服务有限公司，上海，Lot.50175111)，ImPromⅡReverse Transcription System逆转录试剂盒(Promega公司，美国，Lot.00322404)，FstaStart Universal SYBR Green Master实时定量 PCR试剂盒(Roche公司，德国，Lot.154041020)。

1.2 仪器 恒温二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)，厌氧培养箱(美国Thermo公司)，倒置相差光学显微镜(德国Leica公司)，新颖立式小容量恒温摇床(上海世平实验设备有限公司)，高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，全自动生化分析仪(日本日立 7020型)，多功能读板机(瑞士Tecan公司)，核酸蛋白分析仪(美国Beckman)，PCR-C1000逆转录仪(美国Bio-Rad公司)，7500型实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems)。

1.3 心肌细胞原代 出生3天内的Wistar乳鼠，消毒后取心脏，冲洗、剪碎、反复消化，收集上清液，离心，重悬细胞沉淀后接种至培养瓶，差速贴壁培养90分钟，分离心肌细胞，加入0.1 mmol/L的5-brdu后，放入细胞培养箱［6］。培养3天后，心肌传代并以2.5×105个/mL的密度种入24孔板和6孔板，48小时后镜下观察可见纯净心肌细胞，成簇或单层，同步性搏动，频率为80～120次/min，细胞状态良好，可用于实验。

1.4 实验分组 本实验分为空白组(Control)、缺氧损伤组(H/R)、芪参益气预适应组(QS)、缺氧预适应组(HPC)、缺氧预适应+NAC组(HPC+NAC)、缺氧预适应+NAC+芪参益气预适应组(HPC+NAC+QS)。

1.5 实验过程 第一代心肌细胞培养48 h后，换DMEM/F12同步24 h。同步后，各组实验过程如下：Control组：将培养液置换成全培基(由90%DMEM/F12培养基，10%胎牛血清以及1%双抗组成)，放入正常培养箱中培养，直到实验结束。H/R组：将培养液置换成全培基，培养28小时20分钟后，放入94%N2-5%CO2-1%O2的缺氧培养箱中26小时(缺氧箱内环境达到缺氧条件O2＜1%约需2小时)，取出放入正常培养箱中复氧2 h，结束实验。QS组：换含芪参益气0.5 mg/mL的培养液培养1小时，余操作同H/R组。HPC组：将培养液置换成全培基后，放入缺氧培养箱中2小时40分钟(缺氧箱内环境达到缺氧条件O2＜1%约需2小时)，再取出放入正常培养箱中复氧40分钟，之后正常培养24小时，余操作同H/R组。HPC+NAC组：换含1 mmol/L的NAC溶液培养30分钟，后同HPC组操作。HPC+NAC+QS组：换含芪参益气0.5 mg/mL的培养液培养30分钟，后加入1 mmol/L的NAC继续培养30分钟，后同HPC组操作。注：芪参益气滴丸溶液的作用浓度及作用时间均根据前期实验结果确定，为最佳作用浓度及作用时间。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 形态结构观察 倒置相差显微镜下观察细胞形态。

1.6.2 上清液LDH活性测定 留取96孔板每组细胞培养上清液，以全自动生化分析仪测定上清液中LDH活性。

1.6.3 细胞活力测定 弃去96孔板细胞培养上清，每孔加入 100 μL体积比为1∶10的CCK-8与DMEM/F12的混合液，放入孵箱继续孵育2 h，于波长450 nm处，测定各孔吸光度(OD值)。

1.6.4 上清液MDA活性测定 留取24孔板培养细胞上清液，以硫代巴比妥酸法测定脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量。

1.6.5 上清液SOD活性测定 留取24孔板培养细胞上清液，以WST-1法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力。使用酶标仪，测定波长450 nm。

1.6.6 ELISA法测定心肌细胞HSP70蛋白表达 取心肌细胞培养液测定各组HSP70的蛋白浓度。按照大鼠70 kDa热休克蛋白1A(HSPA1A)检测试剂盒说明进行操作，用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)，使用专业软件curve expert 1.30计算出各组样本实际蛋白浓度。

1.6.7 实时定量PCR法测定心肌细胞HSP70 mRNA表达 按照试剂盒提取样本心肌细胞的总RNA，检测RNA的纯度及浓度。以提取的总RNA为模板，根据试剂盒操作步骤反转录合成cDNA。以cDNA为模板行PCR扩增反应，检测HSP70mRNA的相对表达量。引物序列见表1。PCR反应体系：RT-PCR Mix12.5 μL，F-Prime0.5 μL，R-Primer0.5 μL，ddH2O11 μL，cDNA0.5 μL，总体积 25 μL。PCR反应条件：50℃2分钟→95℃10分钟→95℃15秒，60℃1分钟40个循环。每个样品做3个复孔。实验数据根据目的基因和内参基因GAPDH的Ct值，采用2-ΔΔCt法计算出各样本中HSP70 mRNA的相对表达量。

表1 HSP70基因引物序列

1.7 统计学方法 采用SPSS 16.0统计学软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，定量资料以(±s)表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌细胞形态变化 实验结束后，在倒置相差光学显微镜下观察，Control组心肌细胞呈网状，紧密附着在培养皿底部，规律搏动，状态良好；H/R组心肌细胞大部分萎缩且附着不牢、停止搏动；HPC+NAC组心肌细胞有少部分萎缩且附着不牢，大部分细胞保持网状形态但停止搏动；QS组、HPC组、HPC+NAC+QS组有少量心肌细胞停止搏动，大部分细胞呈网状且能够紧密附着、规律搏动，搏动频率略下降＜80/min。

2.2 心肌细胞损伤测定结果 与Control组相比，H/R组 CCK-8降低，LDH升高、MDA升高、SOD活力减少(P＜0.05)，说明缺氧损伤模型组心肌细胞活性与抗氧化力减低、损伤严重，缺氧损伤模型成立；与H/R组相比，QS组与HPC组CCK-8、SOD升高(P＜0.01或 P＜0.05)，LDH、MDA 减少(P＜0.01或P＜0.05)，说明经过中药预适应或缺氧预适应的心肌细胞在经过缺氧复氧损伤后仍表现出很好的细胞活性与抗氧化力，损伤轻；与HPC组比较，HPC+NAC组 CCK-8降低、LDH升高(P＜0.01)，MDA呈升高趋势、SOD活力呈降低趋势，说明NAC抑制了缺氧预适应对心肌细胞的延迟保护作用，在经过缺氧复氧损伤后细胞表现为活性降低、抗氧化能力减弱，损伤较重。HPC+NAC+QS组分别与HPC+NAC组、H/R组比较，CCK-8增高、LDH降低、MDA降低(P＜0.01或P＜0.05)，SOD活力呈升高趋势，说明经过中药与缺氧预适应同时作用的心肌细胞在加入NAC后，细胞仍然可以表现出很好的活性与抗氧化能力，损伤轻。见表2。

2.3 心肌细胞中HSP70蛋白含量与mRNA表达测定结果 Control组与H/R组比较HSP70蛋白含量与mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05)。与H/R组比较，经过中药或缺氧预适应的心肌细胞HSP70蛋白含量与mRNA表达差异有统计学意义(P＜0.05)，蛋白含量 HPC较 QS组含量略高，HSP70 mRNA表达QS较HPC组表达略高。加入NAC后，缺氧预适应的心肌细胞(HPC+NAC)HSP70蛋白含量及mRNA表达差异有统计学意义(P＜0.05)；而中药与缺氧预适应同时作用的心肌细胞(HPC+NAC+QS)，HSP70蛋白含量没有降低反而高于HPC组与QS组，mRNA表达也较HPC组略高，蛋白含量与mRNA均与HPC+NAC组差异有统计学意义(P＜0.05)。总体结果HSP70蛋白含量与mRNA测定基本一致。见表3。

表2 各组QSYQ预适应对缺氧/复氧CM中CCK-8、LDH、MDA、SOD的影响(s)

表2 各组QSYQ预适应对缺氧/复氧CM中CCK-8、LDH、MDA、SOD的影响(s)

注：与H/R组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；与HPC+NAC比较，▲表示P＜0.05，▲▲表示P＜0.01

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表3 各组HSP70蛋白含量及mRNA表达

3 讨论

中药预适应的DP效应在很多研究中已经被证实，本实验结果中芪参益气滴丸对缺氧复氧损伤的心肌细胞发挥了延迟保护作用，其作用效果与缺氧预适应基本一致［7］。HSP70可以主动释放到细胞外，在心肌缺血再灌注损伤的动物模型和临床心肌损伤的患者血清中均能检测到高表达的HSP70［8-9］，HSP70 表达量与患者的病情严重程度密切相关［10］。以往研究表明，以不同方式诱导心肌缺血再灌注损伤模型中HSP70的表达可以发挥显著的心肌保护作用。HSP70是缺血预适应DP效应作用机制中重要的“效应子”，其主要通过抗氧化应激来发挥保护作用。HSP70能够抑制促进氧自由基生成的关键酶的活性(即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶)，通过反馈抑制调节减少氧自由基的生成；HSP70的抗氧化生物活性可以促进机体内源性抗氧化剂的合成和释放增加，HSP70与其结合物可以通过激活蛋白激酶C，增强蛋白酶活性，促进三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)水解，刺激生成超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，从而加快氧自由基的清除，研究发现SODmRNA水平的增高与HSP70mRNA表达的增高相一致［4］。在本实验中，芪参益气滴丸预适应的心肌细胞中HSP70蛋白含量与mRNA表达均显著提高，与缺氧预适应结果一致，结合细胞损伤测定实验的结果，可以说明芪参益气滴丸预适应通过上调HSP70的表达对缺氧复氧损伤细胞达到延迟保护作用。

为进一步确定芪参益气滴丸发挥保护作用的途径，实验中加入特异性抑制剂NAC以阻断“效应子”环节HSP70的表达，结果一方面缺氧预适应的保护作用被取消，同时HSP70的表达被抑制，而另一方面缺氧预适应与芪参益气预适应共同作用的心肌细胞在缺氧复氧损伤后依然保持活力，并且HSP70的表达显著上调。这进一步说明芪参益气滴丸预适应不但能够激发心肌细胞内源性HSP70的释放，而且可以推论其激发机制应是多途径的。通过多途径启动机体内源性调节机制来发挥治疗作用是中医药的作用特点，很多实验研究证实中药对心肌缺血再灌注损伤的保护作用是多因素、多途径的调节过程［11］。正如张景岳云：“凡治病之道，攻邪在乎针药，行药在乎神气。故施治于外，则神应于中，使之升则升，使之降则降，是其神之可使也。若以药剂治其内而脏气不应，针艾治其外而经气不应，此其神气已去，而无可使矣”［12］。

芪参益气滴丸是以现代科技提取黄芪、丹参、三七、降香中的有效成分精制而成的滴丸制剂，是中医传统理论和现代制剂技术结合的结晶［13］。研究证明，黄芪总皂苷可以通过上调HSP70表达发挥对心肌细胞的抗氧化保护作用［14］；丹参酮ⅡA预处理对心肌细胞缺氧复氧损伤有显著的延迟保护作用且与增加HSP70蛋白表达有关［15］；三七总皂苷长时间处理可促进HSP70的表达，对再灌注损伤心肌有良好的保护效应［16］；降香总萜和降香总黄酮在冠心丹参处方对抗心肌细胞缺氧复氧损伤的作用中不可缺如［17］。芪参益气滴丸最大限度的发挥了药物对心肌细胞的保护作用，在对缺氧复氧损伤心肌细胞的保护方面具有与缺氧预适应相当的作用，其作用机制与多途径上调HSP70的表达有关。

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